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病毒可感染所有生物体，并曾引发多次重大流行病与大流行事件。其与宿主防御机制的持续进化博弈，使得开发更精准的工具以解析病毒行为成为迫切需求。推进能够探测病毒附着、膜融合及基因组释放的方法，可深化对感染起始机制的理解，并为有效抗病毒策略的开发提供支撑。在这篇图文综
病毒可感染所有生物体，并曾引发多次重大流行病与大流行事件。其与宿主防御机制的持续进化博弈，使得开发更精准的工具以解析病毒行为成为迫切需求。推进能够探测病毒附着、膜融合及基因组释放的方法，可深化对感染起始机制的理解，并为有效抗病毒策略的开发提供支撑。在这篇图文综述中，研究人员概述了一系列基于显微镜的生物物理方法，其中多数依托细胞外实验体系，可用于解析包膜病毒与非包膜病毒入侵过程中的多个关键步骤。
缩写
本研究涉及的核心缩写包括：原子力显微镜（AFM）、巨型质膜囊泡（GPMVs）、巨型单层脂质体（GUVs）、冷冻电子显微镜（Cryo-EM）、冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）、全内反射荧光显微镜（TIRF）、荧光共振能量转移（FRET）以及干涉散射显微镜（iSCAT）。
受体结合与力学表征
病毒蛋白需首先与宿主细胞受体结合以启动感染。原子力显微镜（AFM）将高分辨率成像与单分子力谱技术相结合，可直接测量结合力、作用寿命及相互作用动力学，是研究该步骤的有力工具。利用AFM已证实人鼻病毒附着涉及多种细胞表面受体；类似方法被用于量化SARS-CoV-2膜结合肽与宿主细胞膜的相互作用，并证明呼肠孤病毒可直接且特异性地结合β1整合素，且该结合动力学受二价阳离子调控。除受体结合外，AFM还广泛应用于病毒力学研究及病毒衣壳的可控破坏。相关研究显示，腺病毒蛋白V可增强衣壳稳定性，而HIV在成熟过程中会发生刚度转换，这种软化现象与其细胞入侵能力直接相关。
光学镊子力测量
光学镊子是另一种重要的力测量技术。通过使用包被天然膜的微球，可对病毒蛋白与受体的相互作用进行定量分析。此外，光学镊子还能定量测量病毒融合蛋白与靶膜之间的结合力，揭示膜融合前最早步骤的机制特征。此类测量可解析结合能景观及膜结合事件，而这些过程通常难以通过其他方法观测。
病毒融合的囊泡平台
对于包膜病毒，附着宿主细胞受体后，病毒融合蛋白发生构象变化，暴露融合肽并插入靶膜，驱动膜融合并释放病毒遗传物质。巨型质膜囊泡（GPMVs）与巨型单层脂质体（GUVs）等囊泡平台，可对膜附着与融合过程进行可控研究。GPMVs保留了质膜接近天然的脂质与蛋白质组成，可用于测量SARS-CoV-1的受体结合动力学及早期融合步骤。相比之下，GUVs与合成脂质体能精确控制脂质组成，而脂质组成会影响融合效率，但将病毒蛋白重构到GUVs中存在技术挑战。值得注意的是，GUVs与GPMVs均可通过微管抽吸，以探究膜张力对膜融合的影响。
冷冻电镜结构解析
冷冻电子显微镜（Cryo-EM）通过在成像前对样品进行玻璃化冷冻，可保留近天然结构并实现近原子级分辨率的结构测定。该技术可直观展示肠道病毒颗粒如何排出衣壳五聚体以实现基因组释放，以及iflavirus衣壳的开壳过程。此外，冷冻电子断层扫描（Cryo-ET）通过倾斜系列图像重建三维体积，可在天然背景下可视化结构。因此，Cryo-ET能直接观察病毒膜融合过程，将融合中间态沿刺突蛋白经历广泛构象重排的机制路径进行定位，或展示HIV包膜蛋白在病毒颗粒上的组织形式及其在成熟过程中的变化。
单病毒荧光追踪
单病毒荧光显微镜可对单个病毒颗粒结合并融合特定靶膜的过程进行实时追踪。通过荧光标记膜与内容物，可监测膜融合前的逐步过程。由于每个病毒颗粒被独立观测，该方法特别适用于在单颗粒水平解析初始附着及后续融合事件，可提供关键机制见解，例如胆固醇如何提升流感病毒的膜融合效率。
全内反射荧光显微镜应用
全内反射荧光（TIRF）显微镜利用玻璃-样品界面产生的倏逝场，仅选择性激发靠近膜的荧光基团，能以极低背景灵敏检测膜上发生的分子事件。TIRF显微镜可实现病毒在膜表面的单颗粒追踪，揭示流感病毒的多步融合机制，以及SARS-CoV-2不同变体的差异化膜结合动力学。
荧光共振能量转移动态监测
荧光共振能量转移（FRET）是一种依赖于距离的激发态供体荧光团向邻近受体荧光团的短距离能量转移现象。这种强距离依赖性使FRET成为分子邻近性的极高灵敏度探针，因而成为实时追踪病毒融合事件的强有力工具。FRET同样可用于追踪病毒融合蛋白（及其受体复合物）的构象变化，证实其在受体结合时发生构象改变，并提供受体参与的定量读数。
无标记干涉散射显微技术
干涉散射显微镜（iSCAT）是一种无标记技术，通过散射光与参考光的干涉检测纳米尺度物体，可实现单个病毒颗粒的长期高速追踪且无光漂白效应。结合荧光共定位，iSCAT可解析膜结合病毒颗粒的纳米级平移与旋转动力学，揭示病毒与受体在支撑脂质双层上相互作用过程中的滑动、翻滚及摇摆运动。此外，iSCAT已实现SARS-CoV-2病毒颗粒的高速无标记追踪。
结论
本综述简要讨论了用于研究病毒入侵的多种方法，重点阐述了每种方法如何对应病毒入侵过程的不同步骤。这些互补方法共同提供了病毒附着、融合及基因组释放过程的全景视图。这些方法的进步与新技术的开发，将进一步深化对机制的理解，并支持靶向早期入侵事件的抗病毒策略研发。
致谢
受篇幅限制，研究人员仅选取代表性案例进行介绍，并对未能引用的相关工作表示歉意。R.S.的研究得到以色列科学基金会（批准号1289/20、2303/25）及NSF-BSF（批准号2021793）的支持，同时由欧盟共同资助（ERC ReMembrane项目，编号101077502）。本文表达的观点仅为作者个人观点，不一定反映欧盟或欧洲研究委员会执行机构的立场，欧盟及资助机构不对相关内容负责。
