基于磁水凝胶的周期性刺激增强间充质干细胞小细胞外囊泡释放

《Materials Today Bio》：Magnetic hydrogel-mediated periodic stimulation enhances mesenchymal stem cell small extracellular vesicle release

　　

间充质干细胞（MSCs）来源的小细胞外囊泡（sEVs）因其免疫调节和组织修复潜力，被视为重要的“无细胞”治疗载体。然而，其规模化应用受到常规培养条件下分泌产量低等瓶颈的制约。本研究建立了一种磁控动态机械刺激平台以增强MSCs-sEVs的产量。将超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒嵌入聚丙烯酰胺中，形成磁性复合水凝胶。可变磁场诱导水凝胶发生可逆形变，从而对贴壁细胞施加周期性机械负荷。结果表明，与常规塑料基底相比，对MSCs进行动态负荷显著提高了sEVs的分泌量（最高约5倍），且未改变典型的囊泡形态或大小分布。机制研究表明，该刺激诱导了机械敏感通道Piezo1和核内YAP信号通路上调，从而促进sEVs释放。抑制Piezo1或YAP可减弱这种增强的产生效应，支持了一个“Piezo1-Ca²⁺促进释放，YAP促进多泡体（MVB）生成”的双通路协同模型。该平台为高效、可控的sEVs生产提供了一种经济、简单且前景广阔的解决方案。

再生医学为应对组织损伤和器官衰竭这一全球健康挑战提供了重要框架。基于间充质干细胞（MSCs）的治疗策略，利用其多向分化潜能、免疫调节特性和旁分泌效应，已被广泛研究作为组织修复与再生的重要途径。近年来，越来越多的关注集中在其分泌组上，特别是小细胞外囊泡（sEVs），它们被认为是细胞间通讯的关键介质。sEVs是直径约30-200纳米的膜结合囊泡，包含蛋白质、核酸（如mRNA、miRNA）和脂质等生物活性物质。它们将其内容物传递至受体细胞，从而调控包括细胞增殖、迁移、分化和免疫反应在内的一系列生理和病理过程，在一定程度上复制或模拟了其母体MSCs的治疗效果。由于其纳米尺度的高组织穿透性、低免疫原性、易于储存以及通过工程化改造其内容物以增强靶向性和疗效的潜力，sEVs被认为是极具前景的“无细胞”治疗剂和药物递送载体。然而，将MSCs来源的sEVs卓越的治疗潜力转化为临床现实面临着一个根本性瓶颈：在保证高纯度和一致生物活性的前提下，高效规模化地生产sEVs。传统的sEVs获取依赖于MSCs的体外扩增，然而干细胞培养本身成本高昂、操作繁琐，且易产生批次间差异。更关键的是，在常规培养条件下，MSCs表现出有限的基线sEVs分泌水平。因此，开发新型策略以高效增强MSCs的sEVs分泌对于推动其临床转化至关重要。

目前，增强MSCs-sEVs产量的策略主要集中在微环境调控，可大致分为生化刺激和物理刺激。生化方法，如添加特定生长因子（如TGF-β、bFGF）、细胞因子或小分子，可以适度上调sEVs分泌。然而，这些方法常常伴随着成本高和可能引入外源污染物的局限性，其安全性和可控性有待进一步评估。相比之下，物理刺激因其无创性、精确的参数可控性、易于整合到生物制造流程以及避免化学添加剂的特点，展现出独特的应用前景。物理微环境，如机械和电刺激，被广泛认为是调控细胞行为（包括sEVs的生物发生和释放）的重要因素。研究表明，细胞感知的基底刚度显著影响sEVs分泌：在较软的基底上培养可加速细胞内多泡体（MVB）的转运速率，并增加其与质膜的融合频率，从而促进sEVs释放。此外，施加外部机械负荷也被证明是有效的分泌增强剂。例如，流体剪切应力已被证明可显著提高细胞sEVs产量。这些发现共同指向一条明确的途径：对MSCs施加可控的机械刺激是打开其高产sEVs分泌的“物理钥匙”。

一个关键的技术挑战是如何以高效、无线、动态可控的方式向间充质干细胞传递动态机械刺激，以更好地模拟体内微环境，从而增强sEVs分泌。研究人员设想将磁性纳米材料与智能生物材料相结合。磁性纳米颗粒（MNPs）因其优异的生物相容性、超顺磁性（避免了磁滞和聚集）、易于功能化以及在外部磁场作用下能够产生力、热或位移的能力，在靶向药物递送、纳米传感、磁热治疗和共振成像等领域发挥着重要作用。此外，磁性纳米颗粒的超顺磁性、微小尺寸和经济的制备成本拓宽了其在生物医学工程中的应用。水凝胶作为高含水量的三维网络聚合物，因其物理化学性质类似于细胞外基质、优异的生物相容性、可调节的力学性能以及易于负载细胞和生物活性因子的特点，已成为组织工程和再生医学中理想的细胞载体和培养平台。先前的研究已将磁性纳米颗粒与水凝胶结合，形成新型纳米复合材料，通过施加外部磁场远程动态调控凝胶的力学性能。本研究中，研究人员将MNPs掺入水凝胶，并通过磁场驱动其运动，从而诱导凝胶网络发生形变。这种方法能够对培养在凝胶表面的细胞施加可控的机械刺激，研究人员探究了这种机械刺激对MSCs分泌sEVs的影响。

本研究建立了一种通过动态磁场中磁性水凝胶的变形施加周期性机械负荷来促进MSCs分泌sEVs的新系统。具体而言，在培养皿上方驱动一个永磁体进行往复运动，以产生周期性变化的磁场。嵌入的Fe₃O₄纳米颗粒响应此动态磁场，诱导水凝胶网络发生可逆形变，从而将循环机械刺激传递给贴壁细胞。研究人员制备了适用于所测试条件下MSCs培养的复合磁性水凝胶，并构建了外部磁场平台以实现动态机械负荷。进一步研究了磁性水凝胶特性对MSCs来源的sEVs分泌能力的影响，并探索了该平台影响sEVs产生的生物力学机制。与先前基于压电离子水凝胶的自刺激策略不同，该平台传递的是外施的、动态可调的机械线索。这一区别很重要，因为它使研究人员能够直接研究周期性机械负荷如何调节sEVs分泌及相关机械转导通路。这个可控的机械激活-生物力学反馈系统为提升sEVs产量提供了一种可行的解决方案。

在本工作中，Fe₃O₄ MNPs是诱导外部施加动态磁场的核心组成部分，也是向培养在凝胶基底上的细胞传递机械力的主要载体。研究人员采用改进的双溶剂溶剂热法合成了尺寸为100纳米和160纳米的Fe₃O₄ MNPs。透射电子显微镜（TEM）观察显示，所得颗粒相对均匀，近乎球形，尺寸分布相对集中，中心分别在约100纳米和160纳米。X射线衍射（XRD）分析证实了合成颗粒的Fe₃O₄晶相。在室温下测量的磁滞回线显示，这些颗粒具有较高的饱和磁化值（分别为76和79 emu/g），同时矫顽力和剩磁可忽略不计，表明其在室温下表现出超顺磁性行为。基于MNPs的傅里叶变换红外（FTIR）光谱，581 cm^-1处的吸收峰归属于Fe–O的伸缩振动，表明MNPs表面成功配位了羧基，使其能在水中形成稳定的分散液，便于进一步制备MNPs均匀分散的复合水凝胶材料。

复合磁性水凝胶是通过将MNPs嵌入丙烯酰胺水凝胶基质中形成的。当使用曲柄连杆机构驱动一个周期性振荡的永磁体时，会产生一个动态变化的磁场，该磁场作用于MNPs-丙烯酰胺复合磁性水凝胶。施加在嵌入MNPs上的磁力沿局部磁场线方向，其方向和大小随磁铁的往复运动动态变化。这诱导了MNPs的机械运动，该运动传递到周围的聚合物链，从而介导整个交联网络的局部拉伸和重塑。扫描电子显微镜（SEM）表征显示，在磁场作用下，水凝胶表面/近表面区域的孔隙尺寸显著减小。能量色散X射线光谱（EDS）分析显示，在磁场作用下，面向磁铁的近表面区域Fe信号增强，支持磁场诱导了MNPs在近表面的重分布/富集及伴随的局部结构重塑。移除磁场后，磁性水凝胶的杨氏模量没有显著变化，表明MNPs未从磁性凝胶系统中脱离，且水凝胶的形变是可逆的。通过调整制备水凝胶时单体和交联剂的组成，研究人员使磁性和非磁性水凝胶具有相似的杨氏模量，以尽量减少基底刚度差异对细胞行为的影响。

研究人员利用COMSOL建立了一个与实验装置完全匹配的N52钕铁硼永磁体三维模型。通过记录磁性水凝胶在动态磁场下的运动，获得了具有不同MNPs负载量的水凝胶的代表性运动轨迹，并据此估算了磁驱动的相对时间变化趋势。AO/EB染色显示，在所测试条件下无明显急性细胞毒性，支持了后续体外实验的可行性。

研究人员将细胞培养在塑料培养板和预制备的磁性水凝胶上，然后施加循环变化的磁场（0.17 Hz）。48小时后收集sEVs。结果显示，在非磁性水凝胶上收集的sEVs（约1×10⁵ /细胞）显著少于在磁性水凝胶上收集的（约2.5×10⁵ /细胞），表明磁场介导的无线机械刺激作用于细胞以促进sEVs分泌增加。纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示不同基底上的颗粒大小分布相似。透射电子显微镜（TEM）分析显示，收集的纳米颗粒表现出杯状或盘状的透明膜结构，确认为sEVs。基于TEM图像分析，sEVs的平均直径约为80纳米，圆度约为0.8，无显著差异。因此，周期性机械刺激显著影响MSCs的sEVs分泌，但不影响囊泡大小或形态。此外，这些收集的sEVs在修复人角膜上皮细胞（HCE-T）中能发挥出色作用。

为了排除磁性颗粒泄漏的潜在影响，研究人员在塑料培养板的培养基中单独添加了MNPs。结果表明，先前观察到的sEVs增加与MNPs本身无关。为了排除磁性水凝胶本身表面特性改变的潜在影响，研究人员在不同基底上标准条件下培养细胞。结果表明材料表面对sEVs分泌的影响可忽略不计。为了评估恒定磁场是否足以解释观察到的sEVs分泌增加，研究人员在恒定磁场下进行了对照实验。在此条件下，施加恒定磁场本身不足以重现动态负荷下观察到的显著增强效果。综上所述，上述因素均未导致sEVs数量或粒径的显著变化。这些发现表明，磁场介导的无线周期性机械刺激作为影响sEVs产生的关键因素作用于细胞结构。

此外，研究人员改变了水凝胶中MNPs的粒径和质量分数，发现当MNPs粒径为100纳米、质量分数为1.2 wt%时，MSCs的sEVs分泌效率最高，达到约3×10⁵ /细胞。

先前的研究表明，循环负荷可诱导细胞重取向。当永磁体在水凝胶上方往复运动时，传递的磁力在凝胶网络中诱导水平和垂直方向的周期性形变。本研究中，永磁体在磁性水凝胶上方的水平往复方向被定义为负荷方向，并在细胞取向分析中被指定为90度。因此，研究人员假设这种规则的机械形变将周期性机械信号传递给在其表面生长的细胞。研究人员分析了有无动态磁场负荷下MSCs的取向。荧光染色图像显示，在磁性水凝胶表面，经过1小时的动态磁场负荷后，应力纤维和黏着斑的生长方向发生了适应性改变。为了响应周期性机械负荷，细胞骨架系统在垂直于负荷方向上得到增强和稳定。相比之下，在非磁性聚丙烯酰胺水凝胶上的细胞，无论是否施加磁场，其细胞取向在所有角度上均呈均匀分布。此外，对在含3 wt% MNPs的磁性水凝胶上生长的MSCs的肌动蛋白细胞骨架荧光图像进行傅里叶变换分析，证实了在未加载条件下细胞表现出高度各向异性。这定量证实了细胞群沿垂直于磁铁运动的方向有序重取向。研究人员的模拟结果也证实，在相同的基底应变条件下，垂直于应变方向取向的细胞膜经历较低的表面应力。

细胞内钙离子（Ca²⁺）作为细胞内重要的第二信使，在神经递质释放、肌肉收缩等多种生理过程中发挥关键作用。先前的研究表明，细胞内Ca²⁺浓度升高可促进MVB的形成，同时加速sEVs的释放。当细胞经历外部机械刺激时，细胞膜表面的机械敏感离子通道感知形变并打开，导致Ca²⁺等离子内流，从而增加细胞内离子浓度。在这里，研究人员假设周期性机械负荷触发细胞打开Ca²⁺内流通道，促进Ca²⁺内流，后者作为启动信号增强sEVs分泌。研究人员使用Fluo-4 AM荧光探针标记细胞内Ca²⁺，随后进行快速实时动态成像。结果表明，与非磁性基底相比，磁性水凝胶上的细胞表现出更高的细胞内Ca²⁺荧光水平和明显的时间依赖性波动。这表明细胞在循环机械负荷下确实经历了更频繁和强烈的钙信号事件。这些结果证明，磁控周期性机械负荷有效激活了细胞内钙信号通路。Ca²⁺水平的持续升高和瞬时波动可能是将机械信号转化为囊泡分泌调节的关键早期事件，为阐明机械刺激调节sEVs分泌的分子机制提供了直接证据。

为了进一步阐明机械信号转导的分子机制，研究人员重点关注了关键的机械敏感离子通道Piezo1，它通过感知细胞膜机械力的变化触发Ca²⁺内流。研究人员验证了其在循环机械负荷和非负荷条件下的表达变化。结果表明，机械负荷处理显著上调了细胞Piezo1蛋白表达水平。此外，使用Piezo1特异性抑制剂GsMTx4干预可阻止机械负荷诱导的sEVs数量增加。这种抑制作用功能性地证实了循环机械负荷通过激活Piezo1通道来启动下游钙信号和sEVs分泌通路。这揭示了“机械负荷→Piezo1激活→钙离子内流→sEVs释放”的通路，为理解机械生物学如何调节sEVs分泌提供了机制基础。

在识别了Piezo1介导的机械化学转导通路后，研究人员进一步研究了另一个核心机械敏感因子Yes相关蛋白（YAP）的作用。作为一种关键的核机械信号转导器，YAP已被广泛证明能响应机械刺激并调控多种细胞行为。为了探究YAP驱动的sEVs分泌在磁负荷系统中的作用，研究人员检测了有无周期性机械负荷下的细胞内YAP表达和相应的sEVs分泌。结果显示，机械负荷显著增强了核YAP信号，这与之前处理组较高的sEVs产量相关。此外，这种sEVs生成的增加被维替泊芬（一种YAP抑制剂）显著抑制。这种sEVs产量模式的变化表明，磁控机械刺激诱导的YAP表达上调在sEVs生成中起着至关重要的作用。

基于现有文献和上述实验结果，研究人员提出了以下整合的机制框架：当细胞在磁性水凝胶表面经历周期性机械负荷时，力信号通过膜蛋白（如整合素）被感知和传递，引发细胞骨架重组，驱动YAP核转位和激活。同时，机械敏感通道Piezo1被直接激活，介导钙离子内流。已知YAP激活可上调MVB的生物发生，而钙信号则促进MVB与质膜融合及sEVs释放。因此，Piezo1-Ca²⁺和YAP通路可能在“释放调节”和“生成调节”两个层面协同作用，共同增强sEVs分泌。然而，更强的机械刺激并不一定导致sEVs分泌增加。现有的研究可能为这种现象提供了解释。过去的研究表明，动态机械负荷促进信号蛋白pFAK的积累并刺激新的肌动蛋白丝生成，而增强的细胞骨架则阻碍sEVs的释放。因此，磁控负荷对sEVs分泌的调控实际上可能涉及促进和抑制的双重效应，最终结果由不同信号通路之间的动态平衡和串扰决定。这种复杂性表明，细胞整合多级调控网络以响应其机械微环境，实现对其分泌行为的精确调节。

总之，本研究初步揭示了机械刺激通过平行且可能汇聚的信号节点（Piezo1和YAP）精确调节sEVs分泌的双轴机制，为理解sEVs分泌的机械生物学调控提供了新的理论视角。

本研究成功开发并验证了一种基于磁控机械负荷的创新平台，以有效促进间充质干细胞分泌小细胞外囊泡。研究人员首先制备了一种生物相容性磁性复合水凝胶基底。在外部动态磁场的驱动下，该平台能够实现磁能向作用于水凝胶和贴壁细胞的周期性机械形变的远程转换，表现出高度的可逆性。实验结果表明，与静态培养或非磁性基底相比，这种动态机械刺激显著增强了MSCs来源的sEVs分泌，达到常规条件下水平的5倍，且不影响囊泡的典型形态和大小分布。通过一系列对照实验，研究人员确认这种增强效应源于磁场介导的周期性机械刺激本身，而非材料的磁性特性或表面特性的间接影响。这项工作的意义不仅在于提供了一种用于增强sEVs生产的远程可控物理策略，为克服规模化生产瓶颈提供了新思路，更重要的是，从生物力学角度建立了一个新的理论视角，用于理解基于力的sEVs分泌生物学调控。当然，本研究仍存在一些局限性，例如尚未深入分析sEVs亚群和内容物谱系的变化，MNPs在水凝胶内的空间分布并非完全均匀，在复合磁性软材料中可能存在局部颗粒聚集。尽管当前结果表明这并未改变整体的磁驱动趋势或主要生物学结论，但未来对颗粒分布均匀性和批间差异进行更定量的表征将是有价值的。此外，体内负荷的生物安全性有待进一步评估，所获得的sEVs的治疗功效需要在更多疾病模型中进行验证。展望未来，该磁控平台可进一步优化刺激参数，并扩展到其他具有治疗价值的细胞类型。通过精确编程机械调控以定制sEVs载荷，可能实现功能增强型囊泡制剂的“定制化”生产，推动无细胞治疗策略向更稳健的临床应用发展。