《Visual Neuroscience》：TNF-α modulates Hippo and Wnt/β-catenin signaling pathways in retinal Müller cells in experimental glaucoma
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Hippo和Wnt/β-catenin信号通路与视网膜Müller细胞增殖及去分化为干细胞（前体細胞）相关。然而在哺乳动物中，视网膜损伤与疾病时Müller细胞难以去分化为干细胞，这可能与其视网膜微环境改变有关。TNF-α是青光眼活化视网膜胶质细胞释放的主要炎
Hippo和Wnt/β-catenin信号通路与视网膜Müller细胞增殖及去分化为干细胞（前体細胞）相关。然而在哺乳动物中，视网膜损伤与疾病时Müller细胞难以去分化为干细胞，这可能与其视网膜微环境改变有关。TNF-α是青光眼活化视网膜胶质细胞释放的主要炎性细胞因子。本研究探讨TNF-α对慢性高眼压（COH）实验性青光眼及原代培养Müller细胞中Hippo和Wnt/β-catenin信号通路的作用及机制。COH视网膜中Wnt与Hippo信号关键效应分子β-catenin和YAP的活性被TNF-α抑制。活化的Müller细胞中，TNF-α抑制β-catenin和YAP活性。使用TNFR1拮抗剂R7050干预后，Wnt3a蛋白水平升高，β-catenin、Stat3和YAP磷酸化降低，GSK3β和MST1活性受抑。此外R7050提升Müller细胞增殖并增加Cyclin D1/D2及Nestin蛋白表达。COH视网膜玻璃体内注射R7050可使Müller细胞中Nestin和Ascl1表达上调。结果表明，在COH视网膜中TNF-α通过激活Hippo通路并抑制Wnt/β-catenin通路，抑制Müller细胞的增殖与重编程。
论文解读：TNF-α调控慢性高眼压青光眼视网膜Müller细胞Hippo与Wnt/β-catenin信号通路并抑制其增殖与重编程
一、研究背景与立题依据
青光眼是全球首要不可逆致盲性眼病，以视网膜神经节细胞（RGC）进行性丢失为特征，主要危险因素为眼压（IOP）升高与衰老。目前临床仅靠降眼压及神经保护药物延缓病程，尚无法逆转视功能损害。在低等脊椎动物（如斑马鱼）中，视网膜损伤后可经Müller细胞——视网膜主要胶质细胞——去分化、重新进入细胞周期并不对称分裂产生多潜能视网膜祖细胞，实现全层神经元再生。哺乳动物Müller细胞虽表达SOX2、Nestin、Ascl1（achaete-scute complex homolog-like protein 1）等干细胞标记，但损伤或疾病时几乎不发生有效神经发生，而是呈胶质增生形成胶质瘢痕。已有研究表明Hippo信号通路（关键效应分子Yes-associated protein，YAP）和经典Wnt/β-catenin信号通路参与调控Müller细胞增殖与去分化为前体样状态：Hippo通路活化（YAP磷酸化滞留胞质）抑制哺乳动物Müller细胞增殖与重编程；Wnt/β-catenin信号活化则促进Müller细胞进入细胞周期及后续基因诱导下的神经元分化。青光眼中存在显著神经炎症，活化的视网膜胶质细胞大量释放TNF-α（tumor necrosis factor-alpha）等促炎因子，改变视网膜微环境。鉴于Müller细胞对视网膜内稳态维持与损伤修复具核心作用，研究人员假设：青光眼中升高的TNF-α通过调控Hippo与Wnt/β-catenin信号通路，阻碍Müller细胞向祖细胞状态重编程。本研究以慢性高眼压（COH）小鼠模型及原代Müller细胞为对象展开验证。该论文发表于《Visual Neuroscience》。
二、主要技术方法概述
研究使用6～7周龄雄性C57BL/6J小鼠建立微磁珠前房注入诱导的COH实验性青光眼模型（对侧眼或生理盐水注射为对照），部分动物于造模前2天行玻璃体内注射TNFR1（TNF receptor 1）拮抗剂R7050或生理盐水。原代Müller细胞取自出生后第5～6天（P5–P6）C57BL/6J新生小鼠视网膜，以谷氨酰合成酶（GS）与Iba1双标免疫荧光鉴定纯度（≥97%）。主要检测手段包括：Western blotting检测Wnt3a、β-catenin、磷酸化β-catenin（p-β-catenin）、GSK3β、磷酸化GSK3β（p-GSK3β）、YAP、磷酸化YAP（p-YAP）、MST1（mammalian sterile20-like kinase 1）、磷酸化MST1、Stat3、磷酸化Stat3、Nestin、Cyclin D1/D2等蛋白及其磷酸化/总蛋白比值；免疫荧光组织化学及共定位分析视网膜切片中Nestin与Ascl1在GS阳性Müller细胞中的表达；EdU（5-Ethynyl-2'-deoxyuridine）掺入实验检测Müller细胞增殖率；qPCR定量检测TNF-α mRNA及Cyclin D1/D2 mRNA表达；体外用I组代谢型谷氨酸受体（mGluR I）激动剂DHPG预活化原代Müller细胞，再分别给予TNF-α（10 ng/mL）及TNF-α+R7050（10 μM）处理。数据以均值±标准误表示，采用单因素ANOVA及配对t检验进行统计学分析。
三、研究结果
Dynamic changes in expression of TNF-α in COH retinas（COH视网膜中TNF-α表达的动态变化）
COH造模后术眼IOP自术后第4天起显著高于对侧及假手术眼。qPCR显示COH视网膜TNF-α mRNA于术后1周升至对照的846.4%、2周为534.2%，之后回落至基线，提示慢性高眼压早期伴随显著的TNF-α转录上调。
TNF-α inhibits the activities of β-catenin and YAP in COH retinas（TNF-α抑制COH视网膜中β-catenin与YAP的活性）
Western blotting显示COH视网膜中p-β-catenin/β-catenin比值于术后2周升高（β-catenin信号受抑），p-YAP/YAP比值亦于术后2周升高（Hippo通路活化，YAP活性受抑）。玻璃体内预注射TNFR1拮抗剂R7050可降低COH视网膜中p-β-catenin/β-catenin及p-YAP/YAP比值，表明COH中β-catenin与YAP活性抑制由TNF-α/TNFR1介导。
TNF-α-mediated modulation of Wnt/β-catenin and Hippo/YAP signaling pathways in activated primary Müller cells（TNF-α介导活化原代Müller细胞中Wnt/β-catenin与Hippo/YAP信号通路调节）
DHPG预活化原代Müller细胞后，TNF-α使p-β-catenin升高、p-β-catenin/β-catenin比值上升，Wnt3a无明显变化但加入R7050后Wnt3a上调且p-GSK3β/GSK3β比值下降；β-catenin总蛋白在DHPG+TNF-α组轻度升高，但p-β-catenin显著升高，R7050可逆转此磷酸化并降低p-β-catenin/β-catenin比值。Stat3磷酸化可被TNF-α诱导，R7050使其降至近零。以上说明TNF-α经TNFR1抑制Wnt/β-catenin信号并可能涉及Stat3活化。同期，TNF-α使上游Hippo激酶p-MST1/MST1比值升高，R7050降低之；YAP总蛋白无显著变化但p-YAP升高、p-YAP/YAP升高，R7050降低p-YAP并提高YAP总量使p-YAP/YAP显著降低；胞质/核分离提示TNF-α使YAP滞留胞质磷酸化形式增加，R7050减弱胞质p-YAP并促进YAP核转位倾向。证实TNF-α结合TNFR1激活Müller细胞Hippo通路（MST1→YAP磷酸化），抑制YAP转录共激活功能。
TNF-α inhibits reprogramming of Müller cells through Hippo and Wnt/β-catenin signaling pathways（TNF-α经由Hippo与Wnt/β-catenin信号通路抑制Müller细胞重编程）
EdU掺入显示TNF-α降低DHPG活化Müller细胞增殖率，R7050恢复并显著提升之。qPCR示R7050处理使Cyclin D1与Cyclin D2 mRNA显著上调。Western blotting示TNF-α降低Nestin蛋白表达，R7050使其回升并超越对照组。表明TNF-α抑制Müller细胞增殖（下调Cyclin D1/D2）及去分化标记Nestin表达。
体内COH视网膜全层Nestin与Ascl1荧光强度无组间差异（抗体交叉标记血管），但GS共定位定量发现COH中Müller细胞Nestin与Ascl1维持在低水平，玻璃体内R7050注射显著上调GS? Mülleri细胞中二者荧光强度，提示TNF-α/TNFR1信号抑制Müller细胞向祖细胞样转录状态的部分转变。
四、讨论与结论翻译总结
研究人员讨论指出，哺乳动物Müller细胞在损伤后仅短暂弱增殖并走向胶质瘢痕化而非神经再生，此"开关"可能与Hippo活化及Wnt/β-catenin受抑有关。COH早期视网膜出现β-catenin与YAP瞬时升高趋势（潜在去分化窗口），持续高IOP后二者活性受抑，伴随TNF-α mRNA持续升高。阻断TNFR1可降低COH视网膜及活化Müller细胞中p-β-catenin与p-YAP水平，确认TNF-α经由TNFR1抑制Wnt/β-catenin（促进β-catenin磷酸化降解、降低Wnt3a及升高p-GSK3β）并激活Hippo通路（MST1磷酸化增强→YAP磷酸化滞留胞质、阻碍核转位），从而下调Cyclin D1/D2及干性标记Nestin、Ascl1，抑制Müller细胞增殖与去分化为祖细胞样状态。Stat3磷酸化参与上述过程但具体中介作用待证。MST1激活可能经TRAF2（TNF receptor-associated factor 2）募集至TNF-RSC或TNF-α诱导ROS途径，需在Müller细胞中进一步验证。种属差异致斑马鱼中TNF-α促再生与此处抑制效应不同。
结论（翻译）： 本研究表明，在COH小鼠视网膜中，TNF-α通过结合TNFR1抑制Wnt/β-catenin信号通路并激活Hippo信号通路，从而阻止Müller细胞的增殖与向干细胞重编程。阻断TNFR1可部分恢复Müller细胞中Wnt/β-catenin活性、抑制Hippo通路活化，上调Cyclin D1/D2、Nestin及Ascl1表达，提示拮抗TNF-α/TNFR1信号或可成为促进哺乳动物青光眼视网膜内源性Müller细胞重编程与再生的潜在靶点，但其完全功能验证尚需谱系追踪及功能整合实验证实。
