人多能干细胞来源神经上皮细胞在鸡间脑中发育为驱动视顶盖形成的组织者

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Human pluripotent stem cell-derived neuroepithelial cells develop into an organizer for optic tectum formation in the chicken diencephalon

　　

人脑发育高度依赖次级组织者（secondary organizers）的形成，这些组织者决定沿前后轴（antero-posterior axis）的神经区域特化。由于技术限制和伦理顾虑，人类次级组织者的研究一直较为困难。本研究利用跨物种移植（interspecies transplantations）证明：来源于人多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）的神经上皮细胞（neuroepithelial cells, NECs）在移植入HH11期鸡胚前间脑后，能够获得峡部组织者（isthmic organizer, IsO）的特性，并驱动形成具有完整层状结构的视顶盖。hPSCs来源NECs在初始状态下并不表达全部典型IsO分子，但在移植后以及与宿主组织相互作用过程中获得这些特征。研究进一步表明，经工程化获得的人NECs可作为优势性IsO，覆盖鸡间脑中的局部信号，从而形成中脑性结构，即视顶盖。由hPSCs产生IsO为研究由IsO功能失常所致脑缺陷的发病机制提供了新的机会。

该研究发表于《Frontiers in Cell and Developmental Biology》，围绕人多能干细胞（hPSCs）来源神经上皮细胞（NECs）是否能够在体内获得次级组织者功能这一核心问题展开。次级组织者是胚胎神经上皮中的局部信号中心，负责沿前后轴建立不同神经区段，其中峡部组织者（isthmic organizer, IsO）位于中脑-后脑交界，对中脑、峡部及小脑等区域的命运决定至关重要。既往关于人类次级组织者的研究受制于伦理约束和技术条件，难以直接在人体或人胚中解析其形成与功能。虽然脑类器官为模拟人脑发育提供了重要平台，但其结构可重复性、空间模式稳定性以及完整组织环境方面仍有限。基于此，研究人员建立了人-鸡异种移植体系，将hPSC分化得到的NECs移植入早期鸡胚前间脑，试图在活体发育环境中检验其是否可转化为具有组织功能的IsO样细胞，并诱导宿主神经组织发生可识别的区域重塑。

研究人员首先从1株人胚胎干细胞（hESC）和2株人诱导多能干细胞（hiPSC）诱导获得NECs，再将其移植至HH11期鸡胚前间脑。结果显示，大部分存活胚胎在间脑区域形成异位结构，其中一部分进一步形成具有明显分层的诱导性视顶盖（induced optic tectum, iTeO）。该结构在组织学形态、层状排列、分子标志以及转录组层面均与正常鸡视顶盖（optic tectum, TeO）高度相似，而不同于大脑皮层样组织。更关键的是，移植前的人NECs并不具备完整IsO分子谱，但在移植后逐渐上调FGF8、WNT1、LMX1A、OTX2等IsO相关分子，表现出成熟IsO样特征。由此，研究证明hPSC来源NECs可在宿主发育环境诱导下转化为具有组织功能的IsO样中心，并主导鸡间脑向中脑视顶盖样结构重编程。这一发现为研究IsO异常相关的人类脑发育缺陷建立了新模型。

本研究主要采用以下关键技术方法：首先，使用hESC系RH6及hiPSC系RiPSC4、CiPSC，在体外通过小分子和生长因子调控SMAD、WNT、SHH及视黄酸相关通路，定向诱导NECs；其次，将NECs移植至HH11期鸡胚前间脑，构建人-鸡异种嵌合模型；随后采用组织学染色、免疫荧光、GFP/人特异性抗原示踪、MRI及电生理记录评估诱导组织的结构与功能；最后对移植前后细胞及组织实施RNA-seq，并借助人-鸡嵌合参考基因组进行生物信息学分析，以区分供体与宿主转录信号并解析时序分子变化。样本来源包括多株hPSC细胞系及鸡胚宿主组织。

以下为研究结果的分项解读。

Implantation of hPSC-NECs induces an ectopic optic tectum in the diencephalon of chicken embryos
研究人员首先优化了hPSC向NECs的诱导流程，3天即可获得接近均一表达神经祖细胞标志物的神经上皮细胞，另亦采用既往12天方案作对照。将这些NECs片段移植入HH11期鸡胚前间脑后，约22%–40%的胚胎存活至移植后19天，其中70%–90%的存活胚胎在间脑形成异位结构。组织学分析显示，部分异位结构形成与天然鸡视顶盖高度相似的层状神经构筑，神经元平行脑表面呈切向排列，因此被命名为iTeO。分层型iTeO约占全部iTeO的14%–24%，厚度约为740.6 ± 128.6 μm，且可由不同hPSC细胞系和不同诱导方案稳定获得。值得注意的是，一些iTeO出现软脑膜面及其下方神经层的折叠，而脑室面保持相对平直，提示其发生了真实的组织形态重塑。

为明确该结构是否由人细胞直接构成，研究人员采用GFP标记hESC并结合STEM121、人核抗原（HNA）等人特异性标记进行追踪。结果显示，移植的人细胞主要局限于iTeO的吻侧至背侧中线区域，几乎不进入层状区域本身，说明形成层状iTeO的主体细胞来源于鸡宿主，而不是人供体细胞直接迁入后构建。进一步免疫染色发现，iTeO中GFAP阳性的顶端放射状胶质细胞（apical radial glial cells, aRGCs）具有明显径向延伸排列，可为新生神经元迁移提供支架；RELN主要位于靠近软脑膜表面的上层，提示与神经元迁移和轴突导向相关；OTX2和PAX2阳性则证明该诱导结构具有顶盖/中脑样分化特征；同时未见后脑标志TSHZ2表达，从而支持该组织并非后脑样结构。SOX2与PH3双阳性细胞出现在脑室下区（subventricular zone, SVZ），提示iTeO形成伴随神经祖细胞增殖增强。电生理记录进一步显示，不同层位神经元存在TTX敏感的电压门控Na⁺电流和4-AP、TEA敏感的K⁺电流，能够发放动作电位，并具有突触活动，说明iTeO中的神经元具备电生理活性。

Gene expression in iTeOs resembles gene expression in the normal optic tectum, reflecting generation of electrically active neurons
为了从分子层面判定iTeO性质，研究人员对iTeO、天然鸡TeO及天然鸡大脑皮层（natural chicken cerebral cortex, NCC）进行了RNA测序（RNA-seq）比较。通过人-鸡嵌合参考基因组比对发现，超过99.6%的唯一比对reads来源于鸡细胞，再次证实iTeO层状区主要由宿主细胞构成。主成分分析（PCA）和样本距离热图均显示，iTeO与天然TeO的转录谱高度接近，而与NCC明显分离。差异表达分析显示，iTeO与TeO之间仅有508个显著差异基因，而iTeO与NCC之间则有2011个，说明iTeO在整体分子身份上更接近视顶盖而非皮层。进一步放宽筛选阈值后，iTeO与TeO差异仍然有限，并且两者共享相似的中脑标志基因表达谱。

对iTeO与TeO差异基因的富集分析表明，差异主要集中于细胞黏附、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）-受体相互作用、黏着斑及细胞外基质结构成分等过程。DCX表达在iTeO中显著升高，提示其中存在更强的新生神经元迁移活动和更幼稚的发育状态。GSEA也显示，iTeO富集于ECM-受体相互作用、细胞黏附分子、祖细胞增殖和轴突导向等基因集。综合这些结果，研究人员认为iTeO与天然TeO的差异主要源于发育阶段不同，而非组织身份不同；亦即，iTeO本质上是一个被诱导形成的、处于较早发育阶段的视顶盖样结构。

In vitro differentiated human NECs acquire organizing center potential after transplantation into the chicken diencephalon
接下来，研究人员追问：hPSC来源NECs究竟是在体外已具备IsO特性，还是在移植后才真正获得组织者功能。RNA-seq结果显示，hPSCs向NECs分化过程中，多能性标志下降、神经上皮标志上升，证明定向分化成功。上调基因富集于轴突导向、Wnt信号通路、神经元命运决定和神经元迁移等过程，说明所得NECs具有神经发育潜能。然而，尽管FGF8、WNT1、EN1、EN2、PAX2、PAX5和LMX1B等部分IsO相关基因在体外分化时已有一定变化，FGF8并未成为强烈上调基因，整体上NECs在移植前并不具备完整IsO分子特征。

为区分“宿主诱导人NECs成熟为IsO”与“人NECs诱导宿主形成IsO”这两种可能性，研究人员对移植后不同时间点的人GFP阳性细胞及周边鸡细胞进行时序转录组分析。结果显示，移植前NECs几乎不表达IsO标志FGF8，也不表达前神经脊（anterior neural ridge, ANR）标志FOXG1和丘脑带间限（zona limitans intrathalamica, ZLI）标志SHH。移植后，人NECs逐渐上调WNT、BMP、TGF-β及SHH等通路相关分子，并显著增强IsO标志，尤其是FGF8。与之对应，在移植后第6天和第19天，免疫荧光证实FGF8蛋白在人来源GFP⁺/STEM121⁺细胞中明显表达；同时FGF18、WNT3A和RELN等参与顶盖形成及层化的分泌因子也在这些细胞中出现。OTX2、LMX1A和FOXA2在移植物中的表达则进一步支持这些人细胞维持IsO身份。由于ANR标志FOXG1缺失，且未见ZLI特征，说明移植后形成的并非其他次级组织者，而是偏向IsO样命运。

与此同时，邻近的人细胞周围鸡宿主细胞在移植后早期亦出现FGF8等部分信号分子表达，并伴随EYA1、SIX1等调控FGF8的基因早期表达，提示宿主组织也对移植物做出反应。然而，这些鸡细胞并未稳健表达完整的IsO标志谱，说明其虽被招募进入局部诱导反应，但并未真正获得完整IsO属性。基于此，研究人员认为，移植的人NECs在宿主神经上皮信号作用下成熟为IsO样次级组织者，并以优势性方式驱动宿主间脑重编程，从而诱导异位TeO形成。

讨论部分总结
讨论部分强调，本研究最重要的发现是：hPSC来源NECs在鸡胚前间脑这一特定体内发育环境中，能够从仅具部分IsO相关特征的神经上皮细胞，进一步成熟为具有真实组织功能的IsO样细胞，并诱导宿主形成异位、分层、具电生理活性的视顶盖。该结果表明，人源NECs对邻近胚胎组织的指导性信号高度敏感，可用于模拟复杂形态发生事件。研究还指出，iTeO中放射状胶质纤维的延伸、RELN表达、SVZ增殖增强以及ECM与细胞黏附相关基因上调，共同为层状结构建立、神经元迁移和组织折叠提供了基础。转录组比较进一步证明，iTeO并非皮层样结构，而是与天然TeO高度一致、但发育阶段稍早的顶盖样组织。

研究还讨论了人工hPSC-NEC来源IsO与天然鹌鹑IsO之间的差异。天然鹌鹑IsO移植至同一鸡前间脑区域并不能在HH11期诱导层状顶盖，而hPSC-NECs可以，提示二者与宿主间的相互作用机制不同。hPSC-NECs并非在移植前即完全具备IsO身份，而是在宿主环境中逐步成熟，并可能通过分泌分子改变宿主组织反应性，最终在该时空背景下建立强有力的诱导中心。鸡宿主细胞虽然表达FGF8，但未形成完整IsO谱系，因此主导组织者功能的仍是人移植物。研究同时指出，该体系为后续通过hPSC进行功能获得或功能缺失操作、模拟IsO异常及顶盖畸形相关的人类脑发育障碍提供了实验平台。

研究结论翻译：
综上，研究人员建立了一种通过从hPSCs生成人工IsO样细胞来研究顶盖形成诱导过程的模型。由于可以较为便捷地在人hPSC来源NECs中引入功能缺失或功能获得突变，因此该体系有望用于模拟与IsO缺陷及顶盖畸形相关的人类脑发育及疾病过程。因此，体外hPSC分化与体内鸡胚移植相结合，将有助于进一步鉴定并表征那些对人类脑疾病发病机制至关重要的关键过程。