《Frontiers in Molecular Neuroscience》：A new method for visualizing cerebrovascular vessels
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研究脑血管系统对于基础神经科学和临床医学至关重要，因为大脑的血管网络是动态的，并随衰老和疾病而发生改变。本研究介绍了一种用于可视化脑血管的新方法。该方法简单，无需外源性荧光团（exogenous fluorophores），并允许与额外的分子标记物进行多重标记
研究脑血管系统对于基础神经科学和临床医学至关重要，因为大脑的血管网络是动态的，并随衰老和疾病而发生改变。本研究介绍了一种用于可视化脑血管的新方法。该方法简单，无需外源性荧光团（exogenous fluorophores），并允许与额外的分子标记物进行多重标记（multiple labeling）。该方法将促进与衰老、脑血管疾病和神经退行性疾病相关的血管生成和重塑的脑血管研究。
脑血管系统通过输送氧气、营养物质和其他关键成分，并清除代谢废物，来维持和调节大脑的内环境稳态与功能。作为一个物理基础设施，大脑的血管网络并非静态，其血管架构可根据需求和局部环境发生变化，尤其在脑发育、衰老以及脑血管疾病、神经退行性疾病、脑肿瘤、创伤性脑损伤和癫痫等病理条件下。因此，检查与疾病发生和进展相关的脑血管变化，有助于加深对这些变化的成因、后果及其潜在的细胞和分子机制的理解，并有助于开发临床干预方案。
血自荧光（blood autofluorescence）是一个众所周知的现象，已在生物医学和临床研究中得到应用。研究表明，利用多光子显微镜（multiphoton microscopy），血自荧光可用于识别小鼠和人类气道中的血管。此外，Li等人证明了利用双光子显微镜（two-photon microscopy）和血自荧光在小鼠大脑皮层中识别动脉和静脉的方法。本研究提出了一种基于血自荧光的、与以往任何已发表方法完全不同的脑血管可视化新方法。由于血液在原位得以保留，该方法无需使用外部人工荧光团即可实现脑血管的可视化。与使用免疫荧光或组织化学标记或通过特定化学物质填充血管的传统血管染色方法相比，该方法更简单，无需外源性荧光团或示踪剂，并节省了材料、成本、劳动力和时间。
研究人员使用了Fischer-344大鼠和来自美国国立卫生研究院（NIH）资助的神经生物库（NeuroBioBank）的死后人脑组织。成年大鼠用过量戊巴比妥钠处死后取脑，进行4%多聚甲醛（paraformaldehyde, PFA）固定。对于不保留血液的脑样本，大鼠在处死后经心脏灌注磷酸盐缓冲盐水（phosphate-buffered saline, PBS）和4% PFA。脑组织经30%蔗糖冷冻保护后，用冷冻切片机切成厚度为25-50微米的切片，并使用含N-丁基二乙醇胺和Triton X-100的混合液在37°C下孵育6-8小时进行组织透明化处理。对于多重荧光标记，切片在上述处理后，依次孵育针对胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的鸡抗大鼠一抗、针对离子钙结合适配分子1（ionized calcium-binding adapter molecule 1, IBA1）的兔抗大鼠一抗、相应的二抗（生物素化羊抗鸡IgG），然后孵育Cy5偶联的抗兔IgG和罗丹明偶联的链霉亲和素，最后用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI）复染细胞核。对于凝集素组织化学，切片用FITC或DyLight594偶联的番茄凝集素在4°C下孵育过夜。光学图像使用尼康或蔡司显微镜及扫描仪采集。
结果部分，图1展示了大鼠脑内不同区域血管图像的区域间差异。图2展示了精细毛细血管、带分支的粗大血管以及独特的环状结构，证明了该方法在不使用任何外源性荧光团下的有效性。该方法的基本要求是在原位保留血液。当血液从大脑中移除后，血管结构不再可见，表明血管信号源自血液相关的内源性自荧光。这一特性使其特别适用于通常在死后保留血液的等人脑血管分析。研究人员从NIH赞助的脑库获得了六名不同年龄和死后处理间隔的人类受试者的死后脑组织，并使用相同的方法进行处理。结果显示，在不施加任何外源性荧光团的情况下，人脑中的血管确实可以被可视化，从而证实了该方法在可视化死后人脑血管方面的适用性。
与之前的观察一致，内源性血管信号似乎跨越了宽光谱，并可通过常规使用的光学滤光片观察到，其发射强度按以下降序排列：515-565纳米（FITC）、570-640纳米（Cy3）、412-452纳米（DAPI）和673-712纳米（Cy5）。因此，FITC滤光片最适合可视化与血管相关的内源性自荧光。
为了证明该方法与多重荧光标记和共定位研究兼容且有用，研究人员使用GFAP和IBA1抗体进行了免疫细胞化学染色，并使用DAPI进行了组织化学染色。GFAP免疫标记显示血管被星形胶质细胞突起包裹，IBA1显示血管被小胶质细胞突起包裹并有小胶质细胞附着，DAPI标记显示细胞核与血管共定位。这些结果表明，该方法可以与其他细胞和分子标记物结合，促进对血管发育、重塑和可塑性机制的研究。
可以观察到，虽然血液持续填充血管，但血管内的自荧光强度并非均匀分布。然而，这种不均匀性并不影响血管及其形态结构的识别。
为评估自荧光信号的稳定性，研究人员进行了以下实验：(1) 在固定液中储存长达13个月的处理后脑样本；(2) 在4°C下于PBS中维持长达10个月的处理后脑切片；(3) 在室温避光条件下储存长达10个月的已处理并封片的脑切片玻片。结果显示，在不同的储存条件和时间间隔下，自荧光信号仍然可见且稳健，表明自荧光信号在固定后相对稳定且抗褪色。
为确定新方法是否适用于血管密度分析，研究人员使用了来自四只灌注和四只未灌注大鼠的前额叶皮层切片。每只灌注大鼠的五张切片采用传统的凝集素组织化学方法处理，每只未灌注大鼠的五张切片采用新方法处理。对每张切片随机选择六张不重叠的图像，在20倍物镜下进行血管计数。定量分析显示，新方法（120张图像）与传统凝集素标记（120张图像）测定的血管密度无统计学显著差异。这些结果表明，该新方法适用于血管定量分析，并提供与传统血管标记技术相当的结果。此外，为进行更确切的验证，研究人员在同一组织切片上进行了双重标记实验，通过FITC滤光片成像内源性自荧光信号，并通过TRITC滤光片成像DyLight594偶联的凝集素信号。结果显示双重标记检测到的血管完全匹配，直接证明了两种方法在血管检测上的一致性。
讨论部分指出，利用血自荧光进行生物医学研究并非新概念，但以往利用多光子或双光子显微镜的方法存在局限性，如未在脑组织中验证、不适合深部脑区成像，且需要昂贵的光学系统。本研究引入了一种全新的方法，即通过可视化浸没固定脑样本中的血自荧光信号来检测脑血管。其原理在于，在浸没固定的脑样本中，血液被原位固定并持续填充血管，从而保留了血自荧光。该方法的优势在于：与仅限于通过颅窗进行在体观察且无法成像深部脑区的双光子显微镜方法相比，新方法允许对所有脑区域进行血管可视化；与需要使用外源性荧光团的传统组织化学或免疫细胞化学血管标记技术相比，新方法利用内源性自荧光信号节省了成本；当使用适当的抗体和/或荧光团时，该方法也与多重荧光标记其他细胞和分子标记兼容。虽然目前仅限于脑组织切片，但该方法比透明化整个大脑所需时间更少，比使用外源性荧光团标记血管更具成本效益，并且不需要昂贵的光片显微镜系统。此外，它适用于可视化和分析死后人脑中的血管。该新方法并非旨在取代现有的血管标记技术。如果脑样本已经通过心脏灌注收集，则应使用传统的血管标记技术。然而，如果一项新研究尚未开始，考虑到上述优势，值得考虑这种用于血管成像和分析的替代方法。
该研究的一个重要发现是可以在死后人脑样本中可视化脑血管，无需外部施加的荧光团，从而验证了该方法在人脑样本中的概念可行性。然而，在六名受试者中观察到的血管数量存在差异。由于样本量小，无法确定这种差异是否与不同的年龄、不同的死后处理间隔、死前疾病状况或这些因素的组合相关。需要进一步研究来解决这个问题。由于血自荧光由血浆和不同血细胞中复杂的自荧光分子混合物组成，可以想象在死后处理时间内可能发生血液降解，导致某些自荧光成分分解，从而以时间依赖的方式降低整体自荧光信号强度。虽然血自荧光的轻微降解可能不会影响使用新方法进行的血管分析（只要自荧光信号足够强以便检测并与周围组织区分），但显著的血自荧光降解可能使血管在新方法下无法检测。因此，与许多死后人脑分子分析一样，遵循既定的伦理程序，较短的死后处理间隔更为可取。
尽管可以在死后人切片中可视化血管，但血管内的自荧光强度在某些位置分布不均，这是可以预期的，因为血液是高度复杂的混合物。然而，由于血液被原位固定并持续填充血管，血管密度和形态分析不会受到不均匀分布的荧光信号强度的影响。
由于该方法基于血液的自荧光，在特定条件下（如血脑屏障破坏或脑内出血，例如出血性卒中或创伤性脑损伤）可能会出现问题，因为血液渗漏到实质组织可能会干扰该区域血管的可视化。事实上，几乎每种用于脑血管分析的方法都会受到出血问题的影响。在这种脑样本中，可能无法区分血管内的血自荧光与渗漏血管周围组织中的血自荧光，从而限制了新方法在受影响区域的血管分析中的应用。
总之，研究人员预期该方法将促进脑血管研究，特别是与血管形态及与疾病诊断、进展和治疗结果相关的血管变化的研究。
