《Frontiers in Molecular Biosciences》：APOE3-Christchurch variant enhances neurovascular support functions of iPSC-derived mesenchymal stromal cells
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衰老及阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）等神经退行性疾病与血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）和神经血管单元（neurovascular unit, NVU）进行性功能障碍相关，这会导致血管完整性受损及神经元
衰老及阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）等神经退行性疾病与血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）和神经血管单元（neurovascular unit, NVU）进行性功能障碍相关，这会导致血管完整性受损及神经元脆弱性增加。载脂蛋白E（Apolipoprotein E, APOE）是神经血管功能的关键调节因子，罕见的APOE3-R136S“Christchurch”变体（APOE3Ch）可赋予对AD的保护作用。间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）由于其对血管细胞和神经细胞发挥的旁分泌效应，代表了一类用于治疗神经退行性疾病的有前景的细胞治疗策略。为探究APOE3Ch如何影响MSCs介导的神经血管支持，研究人员采用了同基因背景的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）来源MSCs（iMSCs），其基因型分别为纯合APOE3Ch或APOE3。研究发现，APOE3Ch iMSCs对脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的THP1细胞NFκB激活具有更强的免疫抑制作用。与APOE3 iMSCs相比，APOE3Ch iMSCs在与内皮细胞直接共培养时，还可增强内皮屏障电阻和血管生成能力。此外，APOE3Ch iMSCs的条件培养基较APOE3 iMSCs条件培养基更有效地促进神经突生长。代谢谱分析显示，APOE3Ch与APOE3 iMSCs之间存在差异，提示其代谢韧性发生改变。综上，这些结果表明，iMSCs通过旁分泌机制支持血管和神经元功能，并提示APOE3Ch变体可改善MSC介导神经血管支持的特定方面。本研究强调，将MSC基础治疗与保护性APOE变体相结合，具有靶向衰老和神经退行性过程中的BBB与NVU功能障碍的潜力。
该研究发表于《Frontiers in Molecular Biosciences》，围绕阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）相关神经血管病理与细胞治疗策略交叉领域展开。研究背景在于，衰老是痴呆尤其AD最主要的危险因素，而AD除经典的细胞外Aβ斑块和细胞内tau神经原纤维缠结外，还伴随显著的脑血管系统损害。血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）完整性下降以及神经血管单元（neurovascular unit, NVU）失衡，会进一步加重炎症反应、物质转运异常与神经元损伤，因此血管侧病变已被视为神经退行性疾病进展的重要驱动因素。与此同时，载脂蛋白E（Apolipoprotein E, APOE）是调控脑内脂质运输与神经血管功能的核心分子，APOE ε4是AD最强的遗传风险因素，而罕见的APOE3-R136S“Christchurch”变体（APOE3Ch）则被认为具有显著保护效应。然而，现有研究主要集中于APOE3Ch对淀粉样蛋白与tau病理的影响，其对血管系统和NVU相关功能的作用仍缺乏系统阐明。
在此基础上，研究人员将APOE保护性遗传背景与间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）治疗潜力结合起来。MSCs具有多向分化潜能，并可分泌营养、免疫调节和血管稳定相关因子，对BBB修复、神经支持和炎症控制具有潜在价值。诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）来源MSCs（iMSCs）则进一步提供了可扩增、可重复、同基因背景可控的研究模型。因此，本研究旨在比较纯合APOE3与APOE3Ch同基因背景iMSCs在免疫调节、内皮屏障支持、血管生成促进、神经突生长支持及线粒体代谢方面的差异，从而评估APOE3Ch是否能够增强MSC介导的神经血管支持作用。
方法上，研究人员首先利用KOLF2.1J来源同基因背景iPSC系定向分化获得APOE3和APOE3Ch两类iMSCs，并通过流式细胞术（fluorescence-activated cell sorting, FACS）检测CD73、CD90、CD105验证其间充质表型；采用RT-qPCR和Western blot检测APOE表达与分泌。随后以LPS激活的THP1 NFκB-Luc2报告细胞评估免疫调节作用；通过与人脑微血管内皮细胞（hBMECs）共培养并测定跨内皮电阻（trans-endothelial electrical resistance, TEER）评价屏障功能；以hCMEC/D3管形成实验评估血管生成支持；以iPSC来源神经元及条件培养基处理检测神经突延伸；并应用Seahorse XF Mito Stress Test分析线粒体呼吸。样本来源主要为同基因背景人iPSC衍生细胞体系与标准人细胞系。
研究结果部分具有清晰的层次结构。
3.1 APOE3Ch iMSCs exhibit typical MSC identity
研究人员首先建立并验证了APOE3与APOE3Ch iMSCs模型。FACS结果显示，两组细胞均高表达CD73、CD90和CD105，说明成功获得典型MSC表型。RT-qPCR提示两组APOE mRNA水平无显著差异，但Western blot显示APOE3Ch iMSCs培养基中的分泌型APOE蛋白显著高于APOE3 iMSCs，而胞内APOE水平无明显差异。这表明Christchurch变体并未改变APOE转录水平，却可能影响其分泌、加工或清除。功能上，研究人员利用LPS诱导的THP1 NFκB报告系统检验免疫调节作用，结果显示两类iMSCs均能显著抑制炎症相关NFκB通路激活，而APOE3Ch iMSCs抑制作用略强，提示其免疫抑制潜力有所增强。
3.2 APOE3Ch iMSCs enhance endothelial barrier integrity
为评估对BBB相关内皮屏障的支持作用，研究人员将iMSCs与hBMECs进行transwell共培养，并检测紧密连接相关标志物及TEER变化。免疫染色显示，与内皮单培养相比，加入iMSCs后内皮细胞密度增加，且ZO-1、VE-cadherin、claudin-5和Occludin等连接分子在两种条件下均可检出。更关键的是，连续7 d TEER监测表明，iMSCs可显著提高hBMECs屏障电阻；其中APOE3Ch iMSCs提升作用更强，第7天TEER值较内皮单培养近乎翻倍，也显著高于APOE3 iMSCs共培养组。该结果说明APOE3Ch可增强MSC对脑微血管内皮屏障完整性的支持能力。
3.3 APOE3Ch iMSCs support endothelial tube formation
在血管生成支持方面，研究人员采用hCMEC/D3管形成模型分析iMSCs的周血管样支持效应。结果显示，在直接共培养条件下，APOE3Ch iMSCs组内皮网络形成更丰富，mesh count约为APOE3 iMSCs组的3倍，但统计学上未达显著性。这提示APOE3Ch可能增强MSC促进内皮网络复杂度形成的能力。相对地，当仅使用两组iMSCs的条件培养基处理内皮细胞时，管形成并未出现差异，说明这一优势主要依赖iMSC与内皮细胞的直接接触，而非单纯可溶性分泌因子。研究据此认为，APOE3Ch可能影响细胞接触相关信号或细胞间物质转移过程。
3.4 Secretome from APOE3Ch iMSCs facilitate neurite outgrowth
在神经支持功能上，研究人员将iPSC来源神经元分别暴露于APOE3或APOE3Ch iMSCs条件培养基，并测量神经突长度。结果表明，APOE3 iMSCs分泌组相较对照培养基已可轻度但显著促进神经突延长，而APOE3Ch iMSCs条件培养基的促进作用更强，可诱导更长的神经突生长。该结果说明APOE3Ch不仅影响血管侧支持，也增强了MSC旁分泌介导的神经营养效应，从而有望改善神经连接维持与修复相关过程。
3.5 APOE3Ch iMSCs display altered mitochondrial stress responses
考虑到上述支持功能均依赖能量代谢，研究人员进一步利用Seahorse线粒体应激实验评估两组iMSCs的代谢差异。氧耗率（oxygen consumption rate, OCR）曲线显示，APOE3Ch iMSCs与APOE3 iMSCs在线粒体应激条件下反应不同。参数分析表明，APOE3Ch iMSCs的最大呼吸能力和备用呼吸容量显著升高，而基础呼吸、ATP相关呼吸、质子泄漏及非线粒体耗氧虽呈升高趋势，但未达到显著性。研究人员据此认为，APOE3Ch iMSCs具有更强的生物能储备和代谢适应能力，这可能是其增强旁分泌与细胞支持功能的重要基础。
讨论部分将这些结果整合到AD神经血管病理框架中。论文指出，既往关于APOE3Ch的研究多聚焦于Aβ与tau病理，而本研究补充了其在神经血管支持方面的功能证据。研究结果表明，APOE3Ch并未改变iMSC的基本间充质身份，却提高了APOE蛋白分泌水平，并在免疫抑制、内皮屏障维持、内皮网络形成和神经突生长支持等多个层面表现出优于APOE3的效应。特别是，BBB完整性提升与NVU稳态维持密切相关，而更强的TEER促进作用提示APOE3Ch iMSCs在限制炎性介质旁细胞通透、维持屏障稳定性方面可能更具价值。神经突延长结果则说明，其分泌组分对神经元结构可塑性具有更强促进作用。代谢结果进一步提示，APOE3Ch所带来的线粒体功能优势可能与其更强的神经血管营养支持能力相联系。
论文也指出了研究范围的边界。免疫调节实验仅在THP1炎症模型中开展，尚未在神经退行性疾病更直接相关的内皮细胞、小胶质细胞或神经元炎症模型中验证；血管生成实验中直接共培养差异未达统计学显著；此外，本研究未进行体内实验，因此其治疗转化意义仍需后续验证。即便如此，该研究仍为保护性APOE变体与MSC细胞治疗相结合提供了机制性依据。
研究结论部分可译为：总之，本研究证明，表达保护性APOE3Ch变体的iMSCs与APOE3 iMSCs相比，表现出增强的代谢适能，能够更有效地强化内皮屏障完整性、促进血管生成，并支持神经元突起生长。这些发现揭示了一种多层面的机制，即MSC生物能学状态与APOE共同作用，调控NVU功能及神经营养支持。通过将iMSC代谢状态、APOE变体以及内皮细胞和神经元中的功能结局联系起来，研究结果为将APOE3Ch iMSCs视为减轻衰老与神经退行性过程NVU易损性的潜在治疗策略提供了依据。未来仍需进一步研究其体内疗效及相关分子介质，以推动这些发现向临床相关干预转化。
