《Frontiers in Oncology》：Multidimensional exposure architecture shapes vaping-associated transcriptomic dysregulation in oral epithelium
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摘要：引言：电子香烟（electronic cigarette, e-cig，简称vaping）的使用与上皮组织中基因及分子通路的失调相关，然而剂量和产品特征对vaping相关转录组改变的各自贡献尚未被系统评估。方法：研究人员对电子烟使用者（vaper）、可燃
摘要：引言：电子香烟（electronic cigarette, e-cig，简称vaping）的使用与上皮组织中基因及分子通路的失调相关，然而剂量和产品特征对vaping相关转录组改变的各自贡献尚未被系统评估。方法：研究人员对电子烟使用者（vaper）、可燃香烟吸烟者（smoker）及非使用者（non-user）的口腔上皮细胞进行RNA测序（RNA-sequencing, RNA-seq）。采用经协变量校正的limma-voom模型并进行错误发现率（False Discovery Rate, FDR）控制以评估差异基因表达（Differential Gene Expression, DGE）。研究人员进一步评估了各暴露特异性剂量指标（包括vapers的累积烟油[e-liquid]消耗量、累积尼古丁[e-nicotine]摄入量、vaping年限及血浆可替宁[cotinine]浓度；smokers的包年[pack-year]及血浆可替宁）对转录变化的解释程度。结果：在vapers中，研究人员还考察了设备代际（device generation）和口味类型（flavor type）是否贡献于基因表达变异。Vaping与smoking均相对于非使用者出现转录组失调，差异表达基因（Differentially Expressed Gene, DEG）存在部分重叠。功能富集分析揭示共有癌症及信号通路（含RHO GTP酶循环[RHO GTPase Cycle]）的扰动，以及vapers或smokers各自特异的通路扰动。在vapers中，27.6%的DEGs在所有剂量指标中呈现一致行为（concordant behavior），余下DEGs呈异质性剂量-反应模式。设备代际与口味类型解释了额外且大体不重叠的基因表达变异组分。吸烟相关DEGs中更高比例（54.1%）在各剂量指标中一致受影响，反映更统一的剂量依赖性响应。讨论：上述发现表明vaping相关转录失调受剂量与产品特征的联合影响，突显vaping与smoking间分子扰动的结构性差异。在监管评估中纳入多维度暴露指标及产品特征可更好捕捉e-cig暴露的生物学复杂性，从而为临床、公共卫生实践及监管决策提供依据。
该研究发表于《Frontiers in Oncology》。
研究背景与目的
电子烟（electronic cigarette/e-cig，俗称vaping）含有害及潜在有害成分（Harmful and Potentially Harmful Constituents, HPHCs），虽较可燃卷烟少且浓度低，但长期健康风险未明。既往转录组研究显示vaping引起口腔等上皮组织炎症、免疫及细胞应激相关基因表达改变，但剂量（使用强度、时长）和产品特征（设备代际、烟油口味）分别对vaping相关转录组失调的相对贡献尚无系统评价。口腔上皮是电子烟气溶胶和烟草烟雾直接接触的首个解剖部位，适合作为探查生物学效应的敏感界面。本研究旨在首次系统探讨使用剂量（dose）与产品特征对健康成人vaper口腔上皮细胞基因调控的影响，并以smoker和非使用者作对照，以明确vaping和smoking相关口腔上皮基因表达失调是否依赖于烟草制品使用强度/持续时间（剂量）及产品特性。
研究人员招募83名受试者（vaper n=35，smoker n=24，非使用者 n=24），采集颊部口腔上皮细胞行RNA-seq，调整年龄与性别协变量识别vaper与smoker各自相对于非使用者的差异表达基因（Differentially Expressed Gene, DEG），进而通过序敏敏感性分析（ordinal sensitivity analysis）评估vaping（累积e-liquid、累积e-nicotine、vaping年限、血浆cotinine）与smoking（包年pack-year、血浆cotinine）各剂量指标对DEG表达的解释力，通过名义敏感性分析（nominal sensitivity analysis）评估产品特征（设备代际device generation、e-liquid口味flavor）的影响，最后对DEGs做基因本体（Gene Ontology, GO）及Ingenuity Pathway Analysis（IPA）功能富集。
主要关键技术方法
研究队列为洛杉矶地区招募的健康成人：现行vaper（≥3次/周，≥6个月，无卷烟等其他烟草品6个月内）、现行smoker（≥3次/周，≥1年，无其他烟草品6个月内）、非使用者（终生≤5次，近6月无使用）。口腔上皮细胞以Ultra Soft Oral-B刷刮取双侧颊黏膜，总RNA提取后用Kapa HyperPrep kit（RiboErase rRNA去除）建库，Illumina NextSeq 500平台单端75 bp测序。原始reads用STAR比对hg38，Partek E/M法定量，edgeR的filterByExpr过滤低表达基因。主模型用limma包经验贝叶斯 moderated t检验（调整年龄、性别），|log2FC|>0.585（|FC|>1.5）且FDR<0.05定义DEG。序敏敏感性分析将各剂量指标按组内中位数分为低/高暴露，与非使用者合为三水平有序变量重新拟合limma模型；名义敏感性分析将设备代际（1st/2nd/3rd/multiple）和口味（甜/果/薄荷薄荷醇[mint/menthol]/混合）各水平分别与非使用者比较。功能富集用IPA及Enrichr（REVIGO去冗余）。
研究结果
3.1 研究人群概览（Overview of the study population）
vaper中位vaping年限3.0年，累积e-liquid中位5279 mL，累积e-nicotine 21920.3 mg，60%用第三代设备，42.9%混用多种口味；smoker中位吸烟23.0年，中位12.3包年；vaper与smoker血浆可替宁均显著高于非使用者（中位分别113.9 ng/mL与122.0 ng/mL vs 2.5 ng/mL，p<0.001），三组年龄、性别分布有差异但已纳入模型校正。
3.2 主模型｜全基因组差异基因表达分析（Primary model | genome-wide differential gene expression analysis）
vaper vs 非使用者鉴定DEG 3124个（上调888，下调2236）；smoker vs 非使用者鉴定DEG 2180个（上调894，下调1286）。vaper特有DEG占其总数60.1%（1878个），smoker特有占其42.8%（934个），共同DEG占vaper的39.9%、smoker的57.2%（1246个），说明vaping与smoking转录改变部分重叠又各有特异性。
3.3 序敏敏感性分析｜剂量依赖性差异基因表达（Ordinal sensitivity analysis | dose-dependent differential gene expression）
在vaper中，按累积e-liquid、累积e-nicotine、vaping年限、血浆cotinine各剂量指标分别做序敏分析，在所有四种剂量指标中均呈显著一致表达（concordant，同方向且FDR显著）的"common DEG"为862个，占主模型DEG的27.6%；至少一种指标显著但非全部（partial DEG）占28.8%。smoker中按包年和血浆cotinine分析，common DEG为1180个（占其DEG 54.1%），partial DEG仅8.6%。表明smoking关联转录响应在剂量指标间较统一，而vaping关联转录响应较分散、受多维度暴露影响更大。
3.4 名义敏感性分析｜产品特异性差异基因表达（Nominal sensitivity analysis | product-specific differential gene expression）
按设备代际分层：仅第3代与混用多代设备亚组检测到显著DEG（分别1747与1367个），第1、2代因样本少未检出，故无跨所有代际之common DEG；若仅考虑第3代与multiple两类别则二者共有的common DEG占主DEG 58.0%，partial DEG占61.0%。按e-liquid口味分层：果味970个、甜味92个、薄荷/薄荷醇27个、混合口味2009个呈显著一致表达，无跨所有口味的common DEG，partial DEG占66.6%。说明不同产品特征捕获基因表达变异中大体不重叠的部分，设备代际与口味本身也是vaping关联转录失调的重要贡献因素。
3.5 功能富集分析（Functional enrichment analyses）
IPA疾病关联显示vaper与smoker DEG最主要关联疾病均为癌症（分别90.8%与92.8%）。共有最显著扰动经典通路为RHO GTP酶循环（RHO GTPase Cycle），另有有丝分裂前中期（Mitotic Prometaphase）、核仁与胞质rRNA修饰（rRNA modification in the nucleolus and cytosol）、细胞周期检查点（Cell Cycle Checkpoints）。vaper独有显著通路涉及纤毛发生/组装（ciliogenesis and assembly）及染色体复制；smoker独有为血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）信号及中性粒细胞脱颗粒（neutrophil degranulation）。GO与KEGG分析示共有条目含核糖体发生（ribosome biogenesis）、有丝分裂姐妹染色单体分离（mitotic sister chromatid segregation）、核仁（nucleolus）、纺锤体（spindle）、细胞周期（cell cycle）、黏着斑（focal adhesion, FA）；vaper独有明显DNA损伤应答（DNA damage response，含错配与碱基切除修复mismatch and base excision repair）、snoRNA结合；smoker独有整合素介导信号调控（regulation of integrin-mediated signaling）、内吞（endocytosis）及自噬（autophagy）。上游调节因子分析提示p53与KRAS可能为共同上游调节子。芳烃受体（Aryl Hydrocarbon Receptor, AHR）信号通路两组均受影响，vaper中31个AHR通路基因失调、smoker中17个，共同分子含HSP90AA1、CDKN1B、CCND1、ALDH18A1、ALDH7A1、MYC、ATM、ATR、CDK4、POLA1、CCNA2。
讨论与结论总结
研究人员指出vaping与smoking均引起口腔上皮显著转录组失调，二者DEG部分重叠（共同通路含RHO GTPase Cycle、细胞周期相关）但vaper特有达60.1%，且功能富集揭示各自独有通路（vaper：纤毛生物发生、DNA修复；smoker：VEGF、整合素信号、中性粒细胞脱ranulation），说明vaping并非smoking的简单低剂量替代。序敏分析显示仅27.6% vaping DEG为各剂量指标共有(common)，远低于smoking的54.1%，且vaping partial DEG比例更高（28.8% vs 8.6%），表明vaping转录改变受剂量与产品特征共同影响，单一剂量指标不足以完整描述其生物学效应；名义敏感性分析进一步证实设备代际与e-liquid口味解释额外且不重叠的表达变异，无跨所有类别之common DEG。研究局限性含队列vaping使用年限短于smoking、早期设备样本量少、未评估性别交互及第四代设备等。结论：vaping与smoking关联口腔
