Herkinorin通过抑制NF-κB通路激活在脊髓损伤后发挥神经保护作用

《Neurochemical Research》：Herkinorin Exerted Neuroprotective Effects After Spinal Cord Injury by Suppression of NF-κB Pathway Activation

　　

摘要：脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）中损伤部位的轴突连续性中断及神经元丢失导致结构断连及功能障碍。Herkinorin是一种结构独特的非氮源性阿片受体激动剂（opioid receptor agonist），在缺血性脑损伤及癫痫模型中显示出显著的神经保护功效。本研究旨在探讨Herkinorin在SCI中对轴突再生及功能恢复的作用及其潜在机制。体外采用氧糖剥夺/复氧（oxygen–glucose deprivation and restoration, OGD/R）条件处理大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12）及原代皮质神经元以模拟SCI环境，检测细胞凋亡。体内采用Allen's撞击法建立大鼠SCI模型。OGD/R条件下用Herkinorin处理细胞。通过足迹分析及BBB评分评估运动功能。Western blot及免疫荧光染色检测微管相关蛋白2（Microtubule-associated protein 2, Map2）、生长相关蛋白43（Growth-associated protein 43, GAP43）和乙酰化α-微管蛋白（acetylated α-tubulin, Ace-tubulin）以评估微管稳定化，检测Bax、Bad、Bcl2及cleaved caspase3评估凋亡。采用TNFα检测NF-κB的表达谱。结果显示，Herkinorin通过增强微管稳定性及抑制NF-κB减轻OGD/R诱导的PC12细胞及原代神经元凋亡和轴突损伤，该效应可被TNFα消除。关键的是，在大鼠SCI模型中，Herkinorin改善运动功能（BBB评分、步态），减轻脊髓神经元丢失及微管解聚。Herkinorin在体内外对神经元损伤均具有神经保护及促再生作用，其机制与微管稳定化及NF-κB通路抑制有关，是SCI治疗的有前景候选药物。

论文解读：Herkinorin通过抑制NF-κB通路激活在脊髓损伤后发挥神经保护作用

脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是一种造成严重健康与经济负担的慢性神经损伤性疾病，轴突再生及与靶组织重新连接被认为是SCI修复的核心难题。目前干细胞移植、生物材料移植及物理刺激等策略在临床前研究中显示出一定潜力，但尚未有可靠手段能恢复神经功能。继发性损伤级联反应主要由神经炎症和细胞死亡驱动，其中核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）通路起关键调控作用——SCI后NF-κB持续激活会加剧促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1β）产生、促进神经元和胶质细胞凋亡、形成抑制轴突生长的微环境；靶向抑制NF-κB可减轻损伤、减小病灶体积并促进功能恢复，是SCI的有效治疗靶点。阿片受体系统特别是δ-阿片受体（delta-opioid receptor, DOR）被证实具内源性神经保护调节作用，某些阿片受体激动剂可通过抑制NF-κB发挥抗炎和神经保护效应。Herkinorin是一种结构独特、无氮的非传统阿片受体激动剂，基于Salvinorin A骨架半合成，对μ-阿片受体（mu-opioid receptor, MOR）亲和力最高，在脑缺血再灌注损伤及癫痫模型中已被证实可通过抑制NF-κB发挥神经保护作用，但其在SCI复杂病理生理过程中的作用及其是否通过调节SCI特异性NF-κB动态变化促进轴突再生尚属未知。本研究首次探究Herkinorin在SCI中的治疗潜能，检验其是否通过抑制NF-κB通路促进功能恢复和轴突再生。

本文发表于《Neurochemical Research》。

主要关键技术方法：

研究人员采用体外氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型（PC12细胞系及原代皮质神经元）模拟SCI缺血缺氧环境，及体内成年雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠T9–T10节段Allen's重物撞击挫伤SCI模型；设置假手术组（Sham）、SCI模型组（SCI）及SCI+Herkinorin（10 mg/kg，腹腔注射每日）治疗组。通过BBB（Basso-Beattie-Bresnahan）运动功能评分及足印分析评价运动恢复；尼氏（Nissl）染色及HE染色评估腹侧运动神经元存活；CCK-8检测细胞活力；Western blot检测凋亡相关蛋白（Bax、Bad、Bcl2、cleaved caspase3）、轴突相关蛋白（Map2、GAP43、乙酰化α-微管蛋白Ace-tubulin、酪氨酸化α-微管蛋白Tyr-tubulin）及NF-κB通路蛋白（磷酸化p65 Ser⁵³⁶、总p65）；免疫荧光染色观察Map2、Ace-tubulin、cleaved caspase3、p-p65 Ser⁵³⁶及生长锥F-actin共染；用TNFα（NF-κB通路激活剂）及JSH-23（NF-κB p65抑制剂）、SLL-637（选择性κ-阿片受体KOR拮抗剂）进行机制验证；数据以均值±标准误表示，采用单因素/双因素ANOVA及Tukey事后检验分析。

研究结果：

Herkinorin Improved Functional Repair in a Rat SCI Model（Herkinorin改善大鼠SCI模型的功能修复）：

通过BBB评分发现SCI组与SCI+Herkinorin组伤后早期（1、3、5天）均呈后肢瘫痪（BBB<5分），无组间差异；第7、14、28天Herkinorin治疗组BBB评分显著高于SCI组（P<0.05）。14天足印分析显示Sham组正常协调步态，SCI组后肢拖行无跖步，SCI+Herkinorin组出现部分负重偶见蹒跚步态。尼氏染色示SCI组腹侧运动神经元显著丢失（P<0.01 vs. Sham），Herkinorin治疗组神经元丢失被部分逆转（P<0.05 vs. SCI）。Cleaved caspase3免疫荧光强度SCI组升高（P<0.01 vs. Sham），SCI+Herkinorin组降低（P<0.05 vs. SCI）。表明Herkinorin促进SCI后功能恢复并减轻神经元凋亡。

Herkinorin Enhanced Axon Regeneration in a Rat SCI Model（Herkinorin增强大鼠SCI模型的轴突再生）：

Western blot显示SCI组Map2、Ace-tubulin、GAP43较Sham组下调，Herkinorin治疗组三者表达较SCI组上调（分别P<0.01、P<0.05、P<0.05）。免疫荧光示SCI组Map2⁺轴突呈片段化弥散，Herkinorin组Map2⁺轴突束更致密连续，荧光强度约为SCI组1.5倍（P<0.05）。表明Herkinorin通过促进微管稳定化有利于轴突再生。

Herkinorin Lessened OGD/R-Mediated Damage to PC12 Cells（Herkinorin减轻OGD/R对PC12细胞的损伤）：

CCK-8示OGD/R 2h致细胞活力下降约50%（P<0.0001），Herkinorin单独处理不影响正常细胞活力，1 μM Herkinorin显著提升OGD/R处理后细胞活力（P<0.0001），选1 μM为后续浓度。轴突长度定量示OGD/R显著缩短轴突（P<0.0001），Herkinorin使其恢复至接近正常水平（P<0.0001）。Western blot示OGD/R上调促凋亡蛋白Bax、Bad，下调抗凋亡Bcl2，Herkinorin逆转此变化；免疫荧光示Herkinorin减弱OGD/R诱导的cleaved caspase3升高（P<0.05）。表明Herkinorin减轻SCI后级联凋亡。

Herkinorin Enhanced Neurite Outgrowth and Sprout In Vitro（Herkinorin增强体外神经元突起生长及出芽）：

PC12及原代皮质神经元中OGD/R降低Map2、GAP43、Ace-tubulin，Herkinorin抵消此下降（P<0.05）。Ace-tubulin/Tyr-tubulin比值Herkinorin组较OGD/R组升高约1.5倍（P<0.05），提示微管聚合增强。F-actin与Ace-tubulin共染示OGD/R组突起出芽减少轴突回缩，Herkinorin恢复生长锥复杂性、延长轴突并减少回缩。表明Herkinorin在体外显著促进轴突生长。

Inhibition of NF-κB p65 phosphorylation plays a key role in Herkinorin-mediated neuroprotection in SCI（抑制NF-κB p65磷酸化是Herkinorin介导SCI神经保护的关键环节）：

Western blot示Herkinorin显著降低OGD/R诱导的p-p65 Ser⁵³⁶上调（P<0.01）。用TNFα（5 μM）激活NF-κB可逆转Herkinorin对Ace-tubulin、GAP43、Map2、Bcl2的上调及对p-p65 Ser⁵³⁶和cleaved caspase3的抑制，并取消Herkinorin对轴突长度的延长效应。选择性KOR拮抗剂SLL-637不影响OGD/R表型，NF-κB p65抑制剂JSH-23单独即可上调再生/抗凋亡蛋白并降p-p65，Herkinorin+JSH-23组与JSH-23单独效果相当。表明Herkinorin主要通过抑制p65磷酸化/活化发挥神经保护作用，此效应不被KOR阻断所影响。

讨论与结论总结：

本研究首次证明Herkinorin在临床相关大鼠SCI模型中具有治疗效果，将其已知神经保护作用从脑损伤拓展至脊髓病理；首次确认轴突再生（包括轴突延长、生长锥出芽及微管稳定化）是Herkinorin的新作用靶点；通过TNFα挽救实验确立NF-κB抑制与促再生效应的因果关系。局限性包括PC12非脊髓神经元、使用雌性SD大鼠、未做完整剂量-反应曲线和药代动力学研究、未探讨对胶质细胞活化的影响。结论：本研究首次提供证据表明Herkinorin可对抗OGD/R诱导的神经元损伤并在大鼠SCI后促进功能恢复，其主要机制为抑制NF-κB通路。Herkinorin是针对急性SCI继发性损伤阶段的有前景的治疗候选物。