《Stroke》：Juvenile Mice Develop Infarct-Induced Neurodegeneration and Emerging Cognitive Decline in a Model of Pediatric Stroke
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背景：超过一半的儿科卒中幸存者存在永久性认知缺陷，这些缺陷可能在卒中后晚期出现。儿科卒中后认知衰退的机制可能与成人不同，因为儿童卒中发生时，大脑和免疫系统仍在发育中。因此，研究人员旨在开发一种梗死诱导的延迟性认知衰退的儿科小鼠模型，以定义与成人相比免疫反应中的
背景：超过一半的儿科卒中幸存者存在永久性认知缺陷，这些缺陷可能在卒中后晚期出现。儿科卒中后认知衰退的机制可能与成人不同，因为儿童卒中发生时，大脑和免疫系统仍在发育中。因此，研究人员旨在开发一种梗死诱导的延迟性认知衰退的儿科小鼠模型，以定义与成人相比免疫反应中的年龄相关差异。方法：将雄性和雌性C57BL/6J小鼠在28日龄时随机分配至卒中或假手术组，以模拟儿童晚期的卒中。研究人员使用永久性远端大脑中动脉闭塞（dMCAO）后60分钟低氧（hypoxia）诱导缺血性皮质卒中。幼年小鼠在手术后1周和7周进行行为测试，使用Barnes迷宫（Barnes maze）和新物体识别（Novel Object Recognition）测试。研究人员通过免疫染色（immunostaining）在幼年和成年小鼠中量化手术后3天和7周的卒中体积、萎缩和神经炎症（neuroinflammation）。结果：手术后1周，幼年卒中和假手术小鼠在认知测试中的表现相当。然而，到手术后7周，两种性别的卒中小鼠在Barnes迷宫的反转学习（reversal learning）中表现显著更差。组织学上，幼年小鼠在卒中后3天于胼胝体（corpus callosum）、皮质脊髓束（corticospinal tract）和丘脑（thalamus）的继发性神经变性（secondary neurodegeneration）位点表现出更强的先天免疫激活，而成年小鼠在卒中后7周于这些位点表现出更强的慢性先天免疫活性。结论：在儿童缺血性卒中模型中，两种性别的幼年小鼠都发展出类似于儿科卒中幸存者的新出现的认知缺陷。这与经历继发性神经变性的未受伤亚皮质结构中的慢性神经炎症相关。研究结果显示，幼年小鼠卒中后发生梗死诱导的神经变性，并且在继发性神经变性位点存在年龄相关的先天免疫反应差异轨迹。图形摘要可在查看器中打开。
论文解读文章
研究背景与目的：
儿科卒中的发病率在全球范围内不断上升，超过70%的幸存者存在永久性认知障碍，主要表现为执行功能、处理速度和认知灵活性的显著缺陷。这些认知障碍可表现为学习障碍，且卒中使儿童发展注意缺陷多动障碍（ADHD）的风险增加至5.7%。部分幸存者甚至在卒中后数年出现新发或加重的认知症状，这一现象虽已得到公认但机制尚不明确。目前，针对儿科卒中的动物研究通常聚焦于梗死灶本身在急性期和亚急性期的过程，而对儿童卒中后慢性认知障碍的细胞和分子机制了解甚少。由于儿童的大脑和免疫系统仍在发育中，其卒中后的免疫反应可能不同于成人。因此，研究人员旨在开发一种幼年小鼠模型，模拟卒中后延迟出现的梗死诱导的认知衰退，并比较幼年和成年小鼠在梗死灶外继发性神经变性位点的免疫反应差异。该论文发表在《Stroke》期刊上。
研究人员开展的研究与结论：
研究人员使用28日龄（幼年）C57BL/6J小鼠模拟儿童晚期卒中，采用永久性远端大脑中动脉闭塞（dMCAO）后60分钟低氧（DH卒中）模型诱导缺血性皮质卒中。通过行为测试（Barnes迷宫反转学习、空间学习和新物体识别）在手术后1周（急性时间点）和7周（慢性时间点）评估认知功能，并通过免疫染色量化梗死体积、萎缩和神经炎症。结果显示，幼年小鼠在DH卒中后1周时认知功能与假手术组无差异，但到7周时出现显著的反转学习缺陷，表明存在延迟出现的认知下降。组织学上，与成年小鼠相比，幼年小鼠在卒中后72小时于胼胝体、皮质脊髓束和丘脑等继发性神经变性位点表现出更强的急性髓系细胞（myeloid cell）激活，而在慢性期（7周）则表现出减弱的髓系细胞炎症。两组小鼠在梗死灶内的慢性淋巴细胞（B淋巴细胞和T淋巴细胞）神经炎症无显著差异。该模型成功模拟了儿科卒中幸存者中常见的执行功能和认知灵活性缺陷，并与继发性神经变性位点的慢性神经炎症相关。
主要关键技术方法：
1. 动物模型：C57BL/6J小鼠购自Jackson实验室，幼年小鼠为出生后28天，成年小鼠为6月龄。卒中模型采用永久性远端大脑中动脉闭塞（dMCAO）后60分钟低氧（8%氧气/92%氮气）诱导皮质缺血。
2. 行为测试：使用Barnes迷宫反转学习范式评估认知灵活性，空间学习范式评估空间记忆，新物体识别测试评估短期记忆，所有行为测试均在手术后1周和7周进行，使用自动化评分软件（BehaviorCloud）分析。
3. 免疫组织化学染色：使用GFAP（胶质纤维酸性蛋白）标记反应性星形胶质细胞，CD68标记活化髓系细胞，Iba1标记小胶质细胞/巨噬细胞，NeuN标记神经元，B220标记B淋巴细胞，CD3ε标记T淋巴细胞，MHCII（I-A/I-E）标记抗原提呈细胞，Plin2标记脂滴。染色在梗死灶、胼胝体、丘脑和皮质脊髓束等区域进行量化，使用Allen小鼠脑图谱定位解剖区域，并使用自定义ImageJ宏进行自动阈值分析。
研究结果：
1. **DH卒中在幼年小鼠中产生可重复、低变异性和低死亡率的皮质卒中**：
- 通过免疫染色（NeuN）分析，dMCAO模型在幼年小鼠中产生较小梗死灶，且20%动物未产生卒中。DH卒中模型显著增加了急性梗死体积，使之与成年小鼠相当，且幼年两性之间无差异。慢性期（7周）梗死侧半球出现萎缩，两年龄组和幼年性别间一致。未观察到同侧海马显著神经元丢失。
2. **DH卒中导致幼年小鼠延迟的梗死诱导的反转学习损伤**：
- 在Barnes迷宫反转学习测试中，手术后1周幼年卒中和假手术小鼠表现无差异。但到7周时，卒中小鼠在训练后期需要显著更长时间定位逃脱孔，而假手术小鼠持续改善。该结果在多个独立队列中重复，且雌性幼年小鼠也表现出类似缺陷。开放场测试排除疲劳或运动功能障碍。空间记忆和短期记忆（新物体识别测试）未受影响。
3. **幼年小鼠在继发性神经变性位点有更强的急性髓系细胞炎症**：
- 在卒中后72小时，梗死灶和梗死周围皮质的CD68和GFAP染色在年龄和性别间无差异。MHCII阳性细胞数量也无显著差异。脂滴（Plin2）在梗死灶小胶质细胞/巨噬细胞中大量积累，但年龄和性别间一致。在胼胝体、丘脑和皮质脊髓束等继发性神经变性位点，幼年小鼠的CD68和Iba1免疫反应性显著高于成年小鼠，而MHCII和GFAP无差异。
4. **DH卒中幼年小鼠在继发性神经变性位点表现出减弱的慢性髓系细胞神经炎症**：
- 在手术后7周，与假手术组相比，幼年和成年卒中小鼠在胼胝体、丘脑和皮质脊髓束中均表现出升高的CD68染色。但幼年小鼠在丘脑和皮质脊髓束中的CD68免疫反应性显著低于成年小鼠，胼胝体中呈降低趋势。幼年小鼠在慢性期的MHCII染色也低于成年小鼠。梗死灶内Plin2阳性脂滴在慢性期极少。
5. **DH卒中在幼年小鼠中引起与成年小鼠相当的慢性淋巴细胞神经炎症**：
- 在卒中后7周，幼年和成年小鼠在梗死瘢痕中均存在持续的B淋巴细胞（B220阳性）和T淋巴细胞（CD3ε阳性）浸润，两组之间无显著差异。
总结讨论与结论：
该研究首次报道了幼年小鼠在皮质卒中后出现延迟性认知下降，且该模型成功模拟了儿科卒中幸存者中常见的执行功能和认知灵活性缺陷。认知缺陷与梗死灶外亚皮质结构（胼胝体、丘脑、皮质脊髓束）的慢性神经炎症相关，这些区域经历继发性神经变性。研究发现，幼年和成年小鼠在继发性神经变性位点的先天免疫反应轨迹存在显著年龄差异：急性期幼年小鼠髓系细胞炎症更强，而慢性期成年小鼠炎症更持续。这种差异可能影响长期认知结局。尽管梗死灶内淋巴细胞炎症在年龄间无差异，但B淋巴细胞介导的神经炎症在成年小鼠中已被证实驱动延迟性神经变性，提示儿科卒中后可能也存在类似机制。研究得出结论：在儿童缺血性卒中模型中，两种性别的幼年小鼠都发展出与儿科卒中幸存者类似的新出现的认知缺陷，这与经历继发性神经变性的未受伤亚皮质结构中的慢性神经炎症相关。研究结果显示，幼年小鼠卒中后发生梗死诱导的神经变性，并且在继发性神经变性位点存在年龄相关的先天免疫反应差异轨迹。这些发现强调了使用年龄特异性模型研究儿科卒中后慢性认知功能障碍机制的必要性。
