在多引物16S rRNA宏基因组学中，针对禽类肠道病原体的高变区特异性检测：V9区域能够识别出常规V3–V4方法无法检测到的Gallibacterium anatis菌株

《Journal of Microbiological Methods》：Hypervariable region-specific detection of an avian gut pathobiont in multi-primer 16S rRNA metagenomics: the V9 region identifies Gallibacterium anatis undetected by conventional V3–V4 approaches

　　

Sharadindu Shil | Shankari Prasad Dutta | Disha Banerjee | Soumita Paul | Ashish Khatua | Jayanta Chowdhury | Gouri Shankar Koner | Amar Krishna Das | Ayan Mukherjee | Utpal Kumar Karmakar | Sudipto Haldar | Anusuya Debnath

印度Brainware大学生物技术系

摘要

在16S rRNA扩增子研究中，可变区域（V区域）的选择对于确定能够被检测到的微生物分类单元至关重要。然而，大多数商业化的家禽肠道微生物组研究仍然依赖于针对Illumina短读长平台优化的V3–V4引物对。Ion GeneStudio S5 Prime试剂盒采用多引物技术，能够从同一样本库中同时扩增六个可变区域（V2、V3、V4、V67、V8、V9），从而为在同一样本集中评估特定区域的分类分辨率提供了前所未有的机会，且不存在样本库间的偏差。本研究分析了29份商业化的肉鸡盲肠样本（健康样本n=10；患病样本n=19），使用Ion GeneStudio S5 Prime和Ion 16S宏基因组学试剂盒对每个V区域进行了分析，共获得46,542条分类读段，这些读段分布在六个V区域中。每个样本的总测序深度范围为342,716至1,358,797条读段。通过QIIME2 v2024.10和DADA2（共检测到738个ASV，SILVA分类为138个）进行了独立的ASV水平验证，结果证实了所有主要发现。V3区域产生的读段数量最多（14,818条，占31.8%），并识别出了最多的属（52个独特属）；而V9区域产生的读段数量最少（2,831条，占6.1%），但识别出了最多的仅存在于该区域的属（11个），其中包括禽类病原菌Gallibacterium anatis。值得注意的是，在所有220条G. anatis读段中，有121条（占55%）仅通过V9引物被检测到；而在所有29个样本中，V3引物均未检测到任何G. anatis读段。在差异丰度分析中，G. anatis是患病肠道微生物群中最显著富集的分类单元（DESeq2 padj = 1.45 × 10^-6）。通过对其中一份样本的计算机模拟分析，发现G. anatis（GenBank PX986441.1）的基因组中不存在341F引物的结合位点。所有区域的平均序列一致性均很高（98.74–99.05%），这表明V9区域的检测效果不佳是由于覆盖范围不足而非质量问题。这些发现表明，在应用于家禽肠道微生物组研究的单区域16S测序方法中存在明显的引物偏好现象，这对诊断检测方法和病原菌监测计划具有直接的影响。