母体抗塌陷反应介导蛋白1抗体诱导子代自闭症样行为

《Neurobiology of Disease》：Maternal anti-collapsin response mediator protein 1 antibody inducing autism-like behaviors in offspring

　　

靶向神经蛋白的母体自身抗体被认为是自闭症谱系障碍（ASD）的重要环境致病因素。尽管在ASD患儿母亲体内已检测到抗塌陷反应介导蛋白1（CRMP1）抗体（Abs），但抗CRMP1抗体在ASD中的致病作用仍不明确。研究人员在本研究中评估了母体抗CRMP1抗体在小鼠模型中诱导病理改变的能力。采用基于细胞的检测（CBA），研究发现母体抗CRMP1抗体在整个妊娠期持续存在，并可在子代出生后第16天检测到其血清中的该抗体。暴露子代在新生期表现出发育里程碑延迟。青春期阶段，暴露小鼠埋弹珠数量增加、自我梳理时间延长，并且在旷场实验中中央区域探索增强，而高架十字迷宫结果无变化，提示重复刻板行为增加及感觉低敏。对出生后第30天子代皮层进行转录组分析显示，胆碱能突触传递正调控相关通路上调，而与轴突导向及突触前膜组织相关的通路下调。进一步证实，与突触前膜组织相关的基因Nrxn1、Pten、Ptprd和Nlgn1表达均显著降低，提示抗CRMP1抗体干扰轴突发育。在体外实验中，抗CRMP1抗体处理可诱导iPSC（诱导多能干细胞）来源未成熟神经元出现更多生长锥塌陷，但不影响基础神经突形态。综上，研究证实母体抗CRMP1抗体可导致子代出现ASD样行为，并通过诱导更多生长锥塌陷破坏早期神经发育，从而确立单一母体抗CRMP1抗体是ASD的重要致病因素。

该论文发表于《Neurobiology of Disease》，围绕母体自身抗体在自闭症谱系障碍（ASD）发病中的作用展开，重点检验抗塌陷反应介导蛋白1抗体（CRMP1抗体）是否能够作为单一致病因子，独立诱导子代出现神经发育异常与ASD相关行为。ASD是一类具有显著临床异质性和复杂病因学背景的神经发育障碍，核心症状包括早发的社会交往受损、交流障碍及重复刻板行为。既往研究提示，除遗传因素外，母体环境因素，尤其是针对神经系统抗原的母体自身抗体，可能通过妊娠期跨胎盘转运影响胎脑发育。临床研究已在ASD患儿母亲血清中检测到多种特异性自身抗体，其中抗CRMP1抗体与子代ASD症状严重程度存在关联。然而，既往动物模型多基于多抗原肽混合免疫，尚难以明确抗CRMP1抗体本身是否具有独立致病性。鉴于CRMP1在胚胎和幼年期脑组织中高表达，并参与神经元生长、迁移、轴突导向及突触形成，因此有必要建立仅针对CRMP1的模型，以澄清其在ASD病理过程中的特异作用。

研究人员首先建立了主动免疫小鼠模型。成年雌鼠经重组人CRMP1蛋白免疫后，能够稳定产生高滴度抗CRMP1抗体。随后，研究人员分别考察该抗体对成年个体本身以及其妊娠所生子代的影响。结果显示，成年携带抗CRMP1抗体的小鼠在焦虑样行为、空间工作记忆和识别记忆等方面均未出现显著异常，提示该抗体在成熟中枢神经系统中未显示出明确致病性。与此相对，妊娠期持续暴露于母体抗CRMP1抗体的子代则出现了从新生期发育迟缓到青春期ASD相关行为异常的一系列改变，说明该抗体的关键病理作用窗口位于早期神经发育阶段而非成年期。

主要技术方法方面，研究采用主动免疫法构建抗CRMP1抗体母鼠模型，并利用基于细胞的检测（CBA）测定母鼠及子代血清抗体滴度，验证抗体在妊娠期持续存在及其跨胎盘传递。对子代进行新生期发育里程碑评估和青春期行为学检测，包括旷场实验、高架十字迷宫、三箱社交实验、埋弹珠、自我梳理、Y迷宫和新物体识别实验。研究进一步对出生后第30天子代大脑皮层进行批量RNA测序（bulk RNA-seq）及GO、KEGG富集分析，并以人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化的未成熟神经元为体外模型，结合免疫荧光评估神经突形态与生长锥变化。动物样本来源为C57BL/6小鼠，细胞实验使用研究团队提供的hiPSCs。

3.1. Establishment of anti-CRMP1 ab mice and their offspring
研究人员成功建立了抗CRMP1抗体母鼠及其子代模型。CBA结果显示，经CRMP1蛋白主动免疫后，雌鼠在免疫后第4周血清抗CRMP1抗体滴度达到1:8000，并在第8周维持于1:8000至1:16000。由高滴度母鼠所生子代在出生后第16天血清中可检测到1:100至1:200的抗体滴度，而对照组母鼠及子代均未检测到相应抗体。该结果直接证明母体抗CRMP1抗体可在妊娠过程中持续存在并转移至子代体内，为后续分析其发育效应奠定模型基础。

3.2. No behavioral deficits in adult with anti-CRMP1 ab
为判断抗CRMP1抗体是否对成年小鼠造成病理影响，研究人员对成年免疫小鼠进行了多项行为学测试。旷场实验中，总行程、中央区行程及中央区停留时间均无组间差异；高架十字迷宫中总臂进入次数及开放臂停留比例也无显著变化；Y迷宫自发交替率和新物体识别指数同样未见异常。由此说明，在成年阶段获得抗CRMP1抗体并不会导致明显的焦虑样行为、认知障碍或活动异常，支持其对成熟神经系统致病性有限的结论。

3.3. Maternal anti-CRMP1 ab exposure causes in developmental delay in offspring during neonatal stage
在新生期发育评估中，暴露于母体抗CRMP1抗体的子代出现了选择性发育迟缓。体重在两组间无显著差异，提示基础代谢未明显受损；体长总体差异不显著，但在出生后第6至8天存在短暂差异。更关键的是，多项生理发育指标延迟，包括下切牙萌出、被毛出现和外耳道开放；同时，多项行为发育里程碑亦延后，如肢体放置反射、悬崖回避、行走及垂直网屏测试。相比之下，前肢抓握、翻正反射和负趋地性等指标未见显著异常。该结果表明，母体抗CRMP1抗体对后代的影响并非广泛抑制生长，而是更集中于神经发育成熟及复杂感觉运动整合功能。

3.4. Maternal anti-CRMP1 ab exposure results in ASD-relevant behaviors in offspring during adolescence
进入青春期后，暴露子代表现出与ASD相关的行为表型。首先，在重复刻板行为方面，暴露组埋弹珠数量显著增加，自我梳理持续时间明显延长，提示重复、刻板样行为增强。其次，在社交行为方面，三箱社交实验未发现明显社会接近障碍或社会新奇偏好缺失，两组均保留对陌生同类的正常偏好。再次，在旷场实验中，暴露组总运动距离增加，中央区域行程比例和停留时间也上升；但高架十字迷宫未发现焦虑水平改变，因此研究人员认为旷场中央探索增强更可能提示感觉低敏而非单纯焦虑降低。最后，新物体识别实验无显著差异，提示识别记忆基本保留。综合来看，母体抗CRMP1抗体暴露所致表型主要集中于重复刻板行为和感觉反应异常，而非全面性社交和认知缺陷。

3.5. Maternal anti-CRMP1 ab exposure induces transcriptional changes in PND30 cerebral cortex
为阐明行为异常的分子基础，研究人员对出生后第30天子代大脑皮层进行转录组分析。差异表达分析共发现1075个差异基因，其中395个上调、680个下调。KEGG富集显示，下调基因主要涉及寿命调控通路和轴突导向通路；GO分析进一步表明，下调基因富集于突触前膜组织和BMP受体活性等与神经发育密切相关的过程，而上调基因则富集于胆碱能神经元突触传递正调控。进一步分析“突触前膜组织”相关基因发现，Nrxn1、Pten、Ptprd及Nlgn1表达均显著下降。这些基因与神经元黏附、突触前后分化及轴突生长密切相关，因此该部分结果支持母体抗CRMP1抗体可能通过干扰轴突导向和突触前结构组织，促发后续ASD相关行为异常。

3.6. Maternal anti-CRMP1 ab induces growth cone collapse of immature neurons
基于转录组结果提示轴突发育异常，研究人员进一步在体外hiPSC来源未成熟神经元中考察抗CRMP1抗体对神经元早期形态建成的影响。免疫荧光结果显示，与对照血清相比，含抗CRMP1抗体的母体血清处理并未改变神经元一级分支数、最长神经突长度或总神经突长度，说明基础神经突形态尚未受明显影响。然而，生长锥面积显著减小，呈现更多塌陷状态。生长锥是轴突导向和神经连接建立的关键亚细胞结构，因此这一结果直接表明抗CRMP1抗体可在发育早期扰乱生长锥稳定性，从而损害神经元成熟和网络组装过程。

讨论部分指出，本研究的重要价值在于将“多抗原母体自身抗体致病”进一步细化为“单一抗CRMP1抗体即可发挥致病作用”。研究结果显示，该抗体对成年小鼠无明显行为学影响，但在妊娠期可通过跨胎盘传递作用于发育中的胎儿脑，造成新生期发育迟缓、青春期ASD样行为、皮层转录组重塑以及未成熟神经元生长锥塌陷。研究还强调，CRMP1在胚胎期和幼年期高表达，这可能解释了其抗体作用的发育阶段特异性。转录组中胆碱能突触传递通路上调可能反映代偿性反应，而轴突导向与突触前膜组织相关通路下调则更加直接指向病理机制核心。总体而言，母体抗CRMP1抗体主要通过破坏早期轴突发育与神经连接建立，参与ASD相关表型形成。

研究结论可译为：研究人员建立了携带抗CRMP1抗体的小鼠模型，结果表明，持续暴露于该抗体可导致子代出现发育迟缓和自闭症样行为。