《Clinical Cancer Research》：CCL3+ Neutrophil Signature Predicts Response to Neoadjuvant Toripalimab plus Chemotherapy in Patients with Hypopharyngeal Squamous Cell Carcinoma: A Phase II Trial
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目的：下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma, HPSCC)预后差。尽管新辅助化疗免疫治疗(neoadjuvant chemoimmunotherapy, nCIT)有前景，但疗效存在异质性，且PD-L1联
目的：下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma, HPSCC)预后差。尽管新辅助化疗免疫治疗(neoadjuvant chemoimmunotherapy, nCIT)有前景，但疗效存在异质性，且PD-L1联合阳性评分(combined positive score, CPS)无法有效分层获益人群。研究人员试图寻找指导患者筛选的生物标志物。患者与方法：在这项前瞻性、单中心、单臂II期试验中，可切除局部晚期HPSCC患者接受两个周期的新辅助Toripalimab、白蛋白紫杉醇和奈达铂治疗。主要终点是病理完全缓解(pathologic complete response, pCR)率。研究人员对部分患者(n = 13)治疗前肿瘤活检标本进行单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)以鉴定疗效决定因素，并在更大队列(n = 60)中使用批量RNA测序(bulk RNA-seq)和免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)进行验证。结果：70例可评估患者中，客观缓解率(objective response rate, ORR)为82.7%。64例接受手术的患者中pCR率为29.7%（95%置信区间[confidence interval, CI], 18.9%–42.7%）。基线PD-L1 CPS与病理缓解无关联(P = 0.313)。单细胞分析显示，缓解者(Responders, R)的治疗前肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)显著富集以CCL3高表达为特征的促炎性中性粒细胞亚群(Neu_CCL3)。源自该亚群的基因特征评分是pCR强效且独立的预测因子（受试者工作特征曲线下面积[Aera Under Curve, AUC] = 0.788），显著优于PD-L1 CPS（AUC = 0.621）。结论：HPSCC中新辅助化疗免疫治疗(nCIT)的疗效由基线以CCL3+中性粒细胞亚群为特征的免疫架构所预先决定。Neu_CCL3基因特征是一个有前景、具临床转化潜力的生物标志物，可填补HPSCC精准免疫治疗中的关键空白。
《CCL3+中性粒细胞特征预测下咽鳞癌新辅助免疫化疗疗效——基于II期临床试验与多组学肿瘤微环境解析》论文解读
本研究发表于Clinical Cancer Research。下咽鳞状细胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma, HPSCC)解剖部位隐匿、确诊时常为局部晚期伴淋巴结转移，预后较其他头颈部鳞癌(Head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)更差。新辅助化疗免疫治疗(neoadjuvant chemoimmunotherapy, nCIT)是潜在策略，但疗效异质性强，标准生物标志物PD-L1联合阳性评分(combined positive score, CPS)预测价值有限，缺乏有效患者分层工具。为此，研究人员开展这项前瞻性单臂II期试验，结合单细胞与批量转录组学解析治疗前肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)，旨在鉴定预测病理完全缓解(pathologic complete response, pCR)的新型免疫特征。
主要关键技术方法：
研究人员入组可切除局部晚期HPSCC患者（中国山东单中心，ChiCTR2400081826），给予2周期新辅助Toripalimab(特瑞普利单抗, 抗PD-1)＋白蛋白紫杉醇＋奈达铂，术后评估pCR。取治疗前活检标本分三批分析——13例做单细胞RNA测序(scRNA-seq, Seurat/Harmony注释细胞亚群、CellChat推断细胞互作)；60例做bulk RNA-seq（ssGSEA计算Neu_CCL3特征评分）；56例制成组织芯片做免疫组化(IHC)及多重免疫荧光(multiplex immunofluorescence, mIF, CD15+CCL3+共定位)。另用小鼠口腔癌MOC1/MOC2移植瘤模型行Ly6G抗体中性粒细胞耗竭及rmCCL3(重组小鼠CCL3)干预验证功能。外部公开数据集(GSE207422等)做签名交叉验证。
研究结果
Patient characteristics and treatment efficacy（患者特征与治疗疗效）
70例完成治疗，64例手术。ORR 82.7%(CR 18.6%)，pCR 29.7%，主要病理缓解(Major pathologic response, MPR, 肿瘤坏死≥90%) 56.3%。PD-L1 CPS与pCR无显著关联(P=0.313)，T/N分期亦无。1/2年总生存(Overall survival, OS)率分别为100%/93%，无事件生存(Event-free survival, EFS)率88.2%/71.1%，方案安全可控（≥3级不良事件4.3%）。
Single-cell profiling reveals baseline TME features associated with nCIT response（单细胞图谱揭示与新辅助化疗免疫治疗疗效相关的基线TME特征）
对13例(6 R/7 NR非缓解者)97,099个细胞的scRNA-seq显示，缓解者基线TME髓系细胞和中性粒细胞比例更高。IHC验证CD15+中性粒细胞浸润显著高于非缓解者，巨噬细胞(CD68+)无差异。Bulk RNA-seq显示缓解者富集炎症/中性粒细胞趋化通路。
Epithelial, B cell, and macrophage programs promote neutrophil recruitment（上皮、B细胞及巨噬细胞程序促进中性粒细胞招募）
恶性上皮细胞高表达CXCL1/2/3/8；记忆B细胞(尤其BM_FCRL4亚群)及三级淋巴结构(Tertiary lymphoid structures, TLS)特征上调，通过配体－受体互作预测增强对中性粒细胞的趋化信号；促炎Macro_CXCL5巨噬细胞亚群(CXCL1/3/5/8+)也显著富集于缓解者并对中性粒细胞有更强趋化预测。三者共同塑造"免疫许可(immune-permissive)"趋化微环境。
Characteristics of the Neu_CCL3 neutrophil subset and its predictive value for immunotherapy response（Neu_CCL3中性粒细胞亚群特征及其对免疫治疗反应的预测价值）
中性粒细胞重聚类鉴定出CCL3高表达促炎亚群Neu_CCL3，在缓解者中显著富集并高分泌CCL3/CCL4/CXCL8。mIF示pCR者CCL3+CD15+密度更高。Bulk RNA-seq中Neu_CCL3特征评分在缓解者升高，预测pCR的AUC=0.788(95%CI)，显著优于PD-L1 CPS(AUC=0.621)；多变量逻辑回归每1-SD增量OR=34.10(P=0.001)，独立预测因子。外部NSCLC及黑色素瘤队列验证具跨癌种判别力。
Neu_CCL3 cells enhance the efficacy of anti–PD-1 therapy in vivo（Neu_CCL3细胞在体内增强抗PD-1疗效）
MOC1/MOC2小鼠模型：抗Ly6G耗竭中性粒细胞削弱抗PD-1抑瘤效果；外源性rmCCL3或骨髓中性粒细胞过继回输联合抗PD-1显著抑制肿瘤生长并促进瘤内CD8+T细胞浸润，证实CCL3+中性粒细胞通过增强效应T细胞招募活化协同提升免疫检查点阻断疗效。
Preexisting CD69-high CD8 T cells with TRM-like features are associated with treatment efficacy（治疗前具组织驻留记忆TRM样特征的CD69高表达CD8+T细胞与疗效相关）
T/NK细胞重聚类发现CD8_CD69亚群在缓解者比例更高，高细胞毒性低耗竭，与肿瘤退缩率正相关(R=0.653)。CellChat示恶性上皮细胞通过HLA?A/C?CD8等配体－受体对与之互作，表明基线即存在具杀伤潜能的早期活化/组织驻留记忆(TRM?like) CD8+T细胞是响应基础。
Neu_CCL3–CD8–macrophage cross-talk supports antitumor immunity（Neu_CCL3–CD8–巨噬细胞互作网络支持抗肿瘤免疫）
CellChat推断Neu_CCL3经CCL3/CCL4–CCR1/CCR5及CXCL16–CXCR6向CD8+T细胞和促炎巨噬细胞发送强招募信号，驱动CXCL9/10、TNF、IFNG表达；巨噬细胞经ICAM1–LFA1、HLA?A/C–CD8、CXCL10–CXCR3等强化CD8+T细胞黏附/抗原提呈，形成"趋化－黏附/提呈－效应"正向反馈环路，构建"热"TME。
讨论与结论
本研究首次在HPSCC新辅助nCIT队列中通过多组学鉴定出治疗前富集于pCR者的CCL3+促炎中性粒细胞亚群(Neu_CCL3)，其基因特征评分独立且优于PD-L1 CPS预测病理完全缓解，机制上通过CCL3–CCR5/CCR1轴招募活化CD8+T细胞及促炎巨噬细胞，并与上皮/B细胞/TLS活性巨噬细胞共同预置免疫许可微环境。局限性含单中心、单臂、全男性、scRNA-seq样本量小及随访OS事件少，需多中心III期验证及IHC检测流程标准化。转化方向含药理诱导Neu_CCL3程序将"冷"肿瘤转"热"。结论：HPSCC中新辅助Toripalimab联合化疗的疗效由以CCL3+中性粒细胞亚群为特征的基线免疫架构预先决定；Neu_CCL3基因特征是具临床转化潜力的生物标志物，可弥补PD-L1 CPS不足，推动HPSCC精准免疫治疗。
