《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A neutrophil elastase-responsive NIR-II fluorescent probe for simultaneous cell and tumor visualization and imaging-guided surgical resection
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朱晓燕|白书宇|马浩月|周丽玲|袁黄宇|邓子杰|李凌云湖南城市大学材料与化学工程学院，中国益阳413000摘要中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）是一种典型的丝氨酸蛋白酶，主要由肿瘤相关中性粒细胞（TANs）分泌，在肿瘤生长、侵袭和转移过程中起着重要作用，因此被视为关键的癌症生物标志物。
朱晓燕|白书宇|马浩月|周丽玲|袁黄宇|邓子杰|李凌云
湖南城市大学材料与化学工程学院，中国益阳413000
摘要
中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）是一种典型的丝氨酸蛋白酶，主要由肿瘤相关中性粒细胞（TANs）分泌，在肿瘤生长、侵袭和转移过程中起着重要作用，因此被视为关键的癌症生物标志物。因此，开发可靠的分析方法来监测生物系统中的NE活性对于肿瘤诊断和术中辅助切除至关重要。基于分子内电荷转移（ICT）机制，我们设计了一种NE激活探针（CNHcy-NE），用于体内NE的第二近红外窗口（NIR-II）荧光成像。CNHcy-NE是通过将半花青素染料与基于全氟丙酰胺的NE底物通过p-氨基苄醇连接剂偶联合成的。该探针对NE具有高选择性和敏感性，检测限为2.36?U/L。成功应用CNHcy-NE探针监测了NE活性，并在细胞水平上可视化了NE的调控。此外，它还通过NIR-II荧光成像区分了肿瘤组织与相邻的正常组织，并在小鼠模型中指导了手术切除。这些发现表明CNHcy-NE作为NIR-II成像引导下的胰腺导管腺癌（PDAC）手术中的实用工具具有潜力。
引言
在快速发展的癌症诊断和治疗领域，开发高保真、无创的成像模式仍然是提高临床效果的关键优先事项[1]，[2]。生物标志物在这一过程中发挥着不可或缺的作用，因为它们可以提供关于疾病存在、进展和治疗反应的宝贵信息，从而指导临床决策[3]，[4]。在各种分子标志物中，中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）是一种主要由肿瘤相关中性粒细胞（TANs）释放的丝氨酸蛋白酶，在肿瘤进展和转移中起着关键作用[5]。NE在肿瘤生长、侵袭和转移中的作用使其成为疾病状态和治疗反应的有希望的生物标志物[6]。胰腺肿瘤基质中NE水平的升高与侵袭性疾病表型相关，包括预后不良、化疗耐药性和生存率降低，尤其是在胰腺导管腺癌（PDAC）中[7]。PDAC细胞异常表达腺泡特异性胰腺弹性蛋白酶IIIA异构体及其变体，增强了细胞外基质（ECM）的降解和基质重塑[8]。此外，浸润的中性粒细胞释放NE，在缺氧条件下，NE切割纤维连接蛋白和IV型胶原蛋白的速度比基质金属蛋白酶（MMPs）快三倍，为癌细胞创造了迁移途径[9]。这种活性与循环肿瘤细胞计数的增加相关，表明NE参与了转移的启动。因此，实时监测NE表达对于优化胰腺癌管理策略至关重要。
然而，传统的方法如体内酶谱分析资源密集，仅限于测量总酶浓度而非功能活性，并且缺乏准确诊断所需的特异性[10]。这些限制突显了迫切需要能够进行体内NE检测的敏感、基于活性的荧光探针。传统的荧光探针存在固有的缺点，包括组织穿透深度浅、自荧光干扰以及在复杂肿瘤微环境中的激活特异性不足。尽管在NE激活探针设计方面取得了进展，但大多数现有平台未能全面解决这些挑战[11]，[12]，[13]，[14]，[15]，[16]，[17]，[18]，[19]，[20]，[21]，[22]。例如，许多探针在非目标组织中表现出较差的药代动力学特性或非特异性激活，影响了诊断准确性。此外，缺乏能够实时监测细胞和组织尺度上NE活性的探针加剧了癌症研究中的转化差距。这一缺陷在PDAC中尤为明显，因为在细胞改变（如NE介导的ECM重塑）和组织水平反应（如治疗后的肿瘤消退）之间建立桥梁仍然是一个关键的未满足需求。
NIR-II探针能够实现深部肿瘤的无创、高对比度成像，使其成为手术指导和纵向疾病监测的理想选择[23]，[24]。然而，研究人员经常不得不为细胞和体内研究使用不同的探针。这种方法不仅增加了实验的复杂性和成本，还引入了不同成像模式之间的不一致性。因此，它无法满足当代生物医学研究的多尺度需求。在癌症成像研究领域，弥合细胞改变（如NE介导的ECM重塑）和组织水平反应（如治疗后的肿瘤消退）之间的差距至关重要。缺乏一种统一的成像策略来跟踪细胞和体内尺度上的NE活性加剧了这一挑战，因为孤立的实验结果难以直接比较。
在这项研究中，我们基于羟基脱保护机制设计了一种新型NE激活的NIR-II荧光探针（CNHcy-NE），这是一种广泛用于刺激响应荧光探针开发的策略，以解决这些挑战。我们首先合成了一种二氰亚甲基衍生的NIR-II染料CNHcy，它表现出优异的光学特性，包括较大的斯托克斯位移和覆盖800–1100?nm的双通道发射[25]。然后，通过将CNHcy支架与基于全氟丙酰胺的NE底物通过p-氨基苄醇连接剂偶联，构建了NE激活探针CNHcy-NE。在生理条件下，由于分子内电荷转移（ICT）受到抑制，探针保持光学惰性。然而，NE介导的全氟丙酰胺部分的切割触发了自消除反应，释放了探针的羟基，并在NIR-I（峰值830?nm）和NIR-II（峰值950?nm）窗口引发了红移发射。这种双峰发射确保了与商用共聚焦系统（NIR-I）和定制的NIR-II体内成像平台的兼容性，实现了细胞、组织和肿瘤的同时成像。我们验证了CNHcy-NE的选择性、敏感性和生物相容性，确认其适用于生理NE检测。使用CNHcy-NE，我们成功监测了内源性NE活性，并可视化了肿瘤细胞中的NE调控。在携带肿瘤的小鼠模型中，CNHcy-NE通过体内NIR-II荧光成像有效区分了肿瘤组织与相邻的正常组织。此外，CNHcy-NE在影像引导的手术切除中用于划定肿瘤边缘的应用进一步证明了其在减少残留肿瘤负担和改善临床研究生存结果方面的相关性。
章节片段
实验部分
中间体I-1、I-2和NIR染料CNHcy的详细合成步骤、细胞毒性测试、活细胞共聚焦成像以及体内NIR-II成像在支持信息中提供。目标探针CNHcy-NE的简要合成路线在方案1中概述。
CNHcy-NE探针的合成： 将NIR染料CNHcy（63.75?mg，0.15?mmol）、Cs2CO3（121.88?mg，0.38?mmol）和NaI（56.25?mg，0.38?mmol）溶解在无水DMF（10?mL）中，并在室温下搅拌
探针CNHcy-NE的设计与合成
我们关注了二氰亚甲基衍生的染料。与其他荧光染料结构不同，它们具有两个能量接近的激发电子态，这两种电子态都以加性方式贡献于超极化性[26]，[27]。通常，二氰亚甲基衍生的染料具有独特的特性，包括能够修改理想结构并利用双发射峰的潜力，同时具有较大的斯托克斯位移。因此，我们设计了
结论
总之，我们基于半花青素染料和分子内电荷转移机制开发了一种NE激活的NIR-II探针（CNHcy-NE），用于高度特异性地检测NE。它对NE表现出快速响应和高选择性，有助于有效成像活细胞中的内源性NE。此外，CNHcy-NE通过NIR II荧光成像有效区分了肿瘤组织与正常组织，并用于指导手术切除。因此，它提供了一种新的
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了中国湖南省教育厅科学研究基金（24C0441）和中国本科生创新创业培训计划（202511527018）的支持。
