《Virology》：Rab4b is associated with inflammatory responses and TLR3-related signaling during Japanese encephalitis virus infection
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杜新云|赵秦|苗昌|李金峰|马宇涵|陈家勇|文一平|吴瑞|严启贵|黄晓波|杜森彦|王一平|郑毅|赵飞|曹三杰中国四川省成都市四川农业大学兽医学院猪病研究中心，邮编611130摘要日本脑炎病毒（JEV）是一种通过蚊子传播的人畜共患病原体，感染后会引起严重的炎症反应。先前的研究表明，
杜新云|赵秦|苗昌|李金峰|马宇涵|陈家勇|文一平|吴瑞|严启贵|黄晓波|杜森彦|王一平|郑毅|赵飞|曹三杰
中国四川省成都市四川农业大学兽医学院猪病研究中心，邮编611130
摘要
日本脑炎病毒（JEV）是一种通过蚊子传播的人畜共患病原体，感染后会引起严重的炎症反应。先前的研究表明，Ras相关GTP结合蛋白4B（Rab4b）与JEV E蛋白之间的相互作用对于病毒进入早期内体至关重要。然而，Rab4b如何促进JEV诱导的炎症反应的具体机制仍不甚清楚。在本研究中，我们构建了一种Rab4b敲除的U251细胞模型，发现Rab4b的缺失显著抑制了病毒复制，并同时降低了包括IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-β在内的关键炎症介质的水平。转录组分析进一步表明，Rab4b的缺失破坏了Toll样受体3（TLR3）相关的基因网络。随后的共免疫沉淀实验证实了Rab4b与TLR3之间的相互作用，而使用TLR3抑制剂处理后，观察到了与Rab4b缺失细胞相似的抗炎表型，这表明Rab4b参与了TLR3相关的信号传导。总之，这些发现支持了Rab4b与JEV感染期间TLR3相关炎症信号通路之间的关联，尽管其确切的机制关系仍需进一步研究。
引言
日本脑炎病毒（JEV）是一种属于黄病毒属的蚊媒病原体，是急性脑炎的主要致病因子，对亚洲和西太平洋地区近40亿人构成重大威胁（Kading等人，2019年）。该病毒的病死率高达30%，大约50%的幸存者会出现持续的神经精神后遗症。鉴于目前缺乏特定的抗病毒疗法，阐明宿主与病毒之间的相互作用对于开发有效的治疗策略至关重要（Wang等人，2024年；Mohsin等人，2022年）。
宿主蛋白对于维持细胞完整性、协调生理功能以及抵御外部病原体至关重要（Zhang和Wang，2023年）。Rab家族的小GTP酶在细胞内膜运输中起着关键调节作用，它们参与黄病毒进入细胞的过程已有充分记录（Elgner等人，2018年）。最近的研究表明，某些Rab蛋白的作用不仅限于介导病毒进入，还参与调节免疫受体的内体运输和区室化，对宿主免疫信号的启动和调节有重要贡献（Beachboard等人，2019年）。值得注意的是，Rab4及其异构体Rab4b在早期内体和再循环内体中起着重要作用。Rab4b不仅参与流感病毒、巨细胞病毒等病原体的感染过程，还参与感染后的核蛋白运输、病毒组装和释放（Ye等人，2025a；McCormick等人，2018年）。此外，Rab4b在基本生理过程中也至关重要，包括抗原呈递、整合素再循环和免疫稳态的维持（Perrin等人，2013年；Christoforides等人，2012年）。
我们之前的研究进一步表明，Rab4b直接与JEV E蛋白相互作用，促进病毒进入早期内体，从而帮助JEV入侵（Miao等人，2025年）。虽然Rab4b在促进JEV进入早期内体中的作用已有充分记录，但其在调节JEV感染后炎症反应中的作用尚未得到充分探索。JEV感染引发的过度炎症反应是导致神经元损伤的关键因素。鉴于Rab4b在免疫调节中的潜在作用，它可能参与了这一病理过程。因此，阐明Rab4b在感染后炎症信号传导中的具体作用至关重要，因为这可能揭示内体运输蛋白如何从促进病毒进入转变为调节宿主免疫反应。此外，这一理解有助于确定Rab4b作为与JEV相关的免疫病理学中的潜在治疗靶点。
JEV感染时，病毒成分作为病原体相关分子模式（PAMPs）被宿主的PRRs（包括TLR3和RIG-I样受体RLRs）识别（Filgueira和Lannes，2019年）。这种识别会诱导构象变化，从而招募如含有TIR结构域的干扰素-β诱导适配器蛋白（TRIF）和线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）等适配器蛋白（Lannes等人，2017年）。这些适配器蛋白随后激活关键的信号通路，特别是核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。这些通路的激活增强了I型干扰素（IFN-α/β）、促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α [TNF-α]、白细胞介素-6 [IL-6]、白细胞介素-1β [IL-1β]）和趋化因子（如单核细胞趋化蛋白-1 [MCP-1]）的表达，从而启动强烈的炎症反应以对抗病毒感染。然而，过度的免疫激活可能导致“细胞因子风暴”，从而加剧组织损伤（Ashraf等人，2021年）。
在多种PRRs中，TLR3是神经元细胞中检测病毒双链RNA（dsRNA）的关键受体。激活后，TLR3通过干扰素调节因子3（IRF3）通路启动抗病毒干扰素反应，并通过NF-κB触发促炎信号级联（Gao等人，2021年）。重要的是，虽然TLR3信号传导对宿主防御机制至关重要，但其失调的激活会加剧JEV引起的神经病理（Lee等人，2017年；Jiang等人，2014年）。
本研究使用人类U251胶质母细胞瘤细胞作为模型系统，以阐明Rab4b在JEV感染及随后炎症反应中的作用。此外，还探讨了Rab4b与TLR3之间的物理和功能相互作用。这些发现有望为理解JEV的免疫病理机制提供新的见解，从而为开发针对宿主蛋白Rab4b的抗病毒和抗炎策略奠定理论基础。
章节片段
细胞和病毒
U251人类胶质母细胞瘤细胞、HEK-293T人类胚胎肾细胞和BHK-21幼年仓鼠肾细胞均来自美国典型培养收集中心（ATCC）。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术生成了Rab4b基因敲除的U251细胞系（U251-Rab4b-KO）。所有细胞系均在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Gibco，11965092）中培养，添加10%胎牛血清（FBS）（ExCell Bio，FCS500）、100单位/mL青霉素和1 mg/mL...
Rab4b敲除对JEV感染的影响
利用CRISPR/Cas9系统生成了U251-Rab4b-KO细胞，随后通过嘌呤霉素筛选和限制稀释，导致Rab4b外显子中发生8个碱基对的缺失，这一点通过Sanger测序得到确认。Rab4b的敲除导致Rab4b mRNA和蛋白质表达显著降低，而细胞增殖和形态未受影响（图S1）。为了阐明Rab4b在JEV生命周期中的作用，我们首先评估了病毒的吸附和内化情况。
讨论
JEV是一种通过蚊子传播的人畜共患病原体，能强烈激活先天免疫系统。然而，这种免疫反应的失调会导致过度神经炎症，从而加剧疾病进展。
本研究表明，Rab4b的缺失显著损害了JEV感染和宿主的炎症反应。在U251敲除细胞中，Rab4b基因的缺失使病毒进入减少了50%以上，并抑制了JEV的复制动力学（图1B）。这些发现与...
结论
Rab4b调节U251细胞中对JEV的炎症反应；其缺失导致病毒复制减少以及包括IL-1β、IL-6、IFN-β和TNF-α在内的炎症介质的产生减少。我们的当前发现表明Rab4b与TLR3相关的信号通路有关；然而，这些发现并未明确证明Rab4b仅通过TLR3发挥作用。为了阐明这一通路的机制层次和生物学意义，需要进一步...
CRediT作者贡献声明
黄晓波：验证。曹三杰：写作——审稿与编辑、监督、资源提供、项目管理、资金获取、概念构思。李金峰：方法学、数据分析。马宇涵：方法学、实验研究。郑毅：软件使用。赵秦：写作——审稿与编辑、资源提供、项目管理、方法学、概念构思。赵飞：软件使用。苗昌：方法学、实验研究、数据管理、概念构思。吴瑞：实验研究。严启贵：
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
数据可用性声明
本研究的数据可根据合理请求向通讯作者获取。
资助
本研究得到了四川省科技支持计划的资助（资助编号：2021ZDZX0010）。
利益冲突声明
? 作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：曹三杰报告称获得了四川省自然资源科学院的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
