硫酸铵为从人体生物液体中分离小型细胞外囊泡提供了一种高效的方法

《Scientific Reports》：Ammonium sulfate provides an efficient method for isolating small extracellular vesicles from human biofluids

　　

摘要

小细胞外囊泡（EVs）是纳米级的囊泡（直径小于200纳米），由包括中枢神经系统（CNS）在内的多种组织分泌到各种生物流体中。由于它们能够携带反映其母细胞生理状态的分子物质，小EVs成为诊断神经退行性疾病（如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）的理想载体。虽然从生物流体中提取的小EVs提供了“液体活检”的解决方案，但其临床应用受到传统分离方法的严重限制——这些方法通常耗时、成本高昂或纯度较低。在“ExoPRISM”（通过离子强度调节沉淀外泌体）框架的基础上，我们开发并验证了一种基于硫酸铵（AS）的优化且经济高效的小EVs分离方法。我们针对血浆优化了AS的使用比例，并进一步证明了该方法从唾液中分离小EVs的可行性。随后，我们引入了使用谷氨酸-天冬氨酸转运蛋白（GLAST）抗体的靶向纯化步骤，以专门分离中枢神经系统（CNS）来源的EVs。这一步骤有力地证明了基于AS的方法能够保持小EVs的完整性，并有效分离出星形胶质细胞来源的细胞外囊泡（ADEVs），为后续研究提供了便利。最后，我们在临床队列中验证了该优化方案的实际应用效果。我们的研究结果突显了这种基于AS的方法的稳健性、高效率以及其在神经退行性疾病早期准确诊断中的巨大潜力。我们优化了AS的浓度，最终确定2.66 M为最佳工作浓度。该方法表现出显著的时间效率，整个分离过程仅需约90分钟。此外，该方法仅需12,000 xg的离心力，大大提高了其在临床诊断中的实用性。为了扩展其应用范围，我们还在其他体液中测试了该方法的效果，发现2.66 M的浓度同样适用于从唾液中分离小EVs。与市售的ExoQuick试剂盒相比，我们的方法在从AD患者血浆中分离小EVs和纯化ADEVs方面表现出相当的效果。通过纳米粒子追踪分析（NTA）、电子显微镜以及经典小EVs标志物（CD63、CD9）的检测，进一步证实了这两种分离方法的功能等效性。本研究的所有证据共同证明了基于AS的小EVs分离方案是一种可行且高效的方法，其效果可与市售试剂盒相媲美。该方法具有三大优势：提高时间效率、降低成本负担，并对下游检测干扰最小，非常适合临床应用。值得注意的是，它能够有效分离血浆（一种广泛用于临床诊断的生物流体）和唾液中的小EVs。这些特点凸显了该方法在推进神经退行性疾病早期检测方面的潜力。展望未来，这种方法的通用性表明其适用于多种生物样本，从而有助于推动基于小EVs的诊断研究和临床实践的发展。