评估一种新型生物膜反应器（Biofilm Reactor）内单菌种及多界（Multidomain）生物膜生长方法：剪切应力（Shear Stress）、稳健性（Ruggedness）、重复性（Repeatability）与重现性（Reproducibility）

《Biofilm》：Assessing a method for single- and multidomain biofilm growth in a novel biofilm reactor: shear stress, ruggedness, repeatability, and reproducibility

　　

摘要：现有实验室规模生物膜反应器（Biofilm Reactor）虽可在设定条件下培养生物膜，但尚无系统能同时提供低剪切应力（Shear Stress）、高气体传递及间歇润湿条件。本研究针对此局限开发了工业表面生物膜反应器（Industrial Surfaces Biofilm Reactor, ISBR），可同时实现上述条件。研究人员首次建立了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在ISBR中生长的标准操作规程（Standard Operating Procedure, SOP），为模拟工业环境下生物膜发育提供了可重现的研究框架。通过对生物膜密度（Biofilm Density）和生物体积（Biovolume）数据的统计分析，并结合ISBR载片（Coupon）的分析剪切应力模型，验证了SOP的重复性（Repeatability）、稳健性（Ruggedness）及重现性（Reproducibility）。结果显示生物膜密度对循环（Recycle）及旋转速率偏差具鲁棒性，但随进液流速（Influent Feed Rate）升高而增加；生物体积对进液流速及旋转速率变化具鲁棒性，但在较高循环流速下降低。两项指标均表现出优异的重复性与重现性，强调评估这些特性对稳定形成生物膜之必要性。此外，作为概念验证，研究人员培养了两种多界生物膜——嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）- Vermamoeba vermiformis 模型及胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）酵母-铜绿假单胞菌细菌共培养物，二者均具高重复性，且共培养物在逾一月生长期内保持稳定。

论文解读：新型工业表面生物膜反应器(ISBR)中单菌种及多界生物膜培养方法的评估与验证

《Biofilm》刊载的本研究针对现有实验室生物膜反应器无法同时模拟低剪切应力（Shear Stress，流体对固体表面的摩擦力）、高气体传递及间歇润湿（Intermittently Wet）工业环境（如冷却塔、换热器）的问题，引入并验证工业表面生物膜反应器（Industrial Surfaces Biofilm Reactor, ISBR, BioSurface Technologies），建立铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442）标准操作规程（Standard Operating Procedure, SOP），系统评估其重复性（Repeatability，同实验室同方法重复结果一致性）、重现性（Reproducibility，不同实验室同方法结果一致性）与稳健性（Ruggedness，微小操作参数波动下结果稳定性），并通过计算流体力学（Computational Fluid Dynamics, CFD）模拟载片（Coupon）表面剪切应力与液膜特征，进一步验证ISBR对多界生物膜（Multidomain Biofilm, MDB，含细菌、原生动物、真菌的混合型生物膜）的培养能力。

主要关键技术方法

研究人员采用2³因子实验设计（旋转速率10–50 RPM、循环流速9–27 mL/min、进液流速0.5–2 mL/min）评估SOP稳健性；以涡旋-超声解离结合涂布计数测定对数生物膜密度 log₁₀(CFU/cm²)；以共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Scanning Laser Microscopy, CSLM）结合LIVE/DEAD?染色及Beer's分析法测定生物体积（Biovolume, μm³）；采用线性混合效应模型（Linear Mixed Effects Model, LMM）进行统计学分析；利用Siemens SimCenter Star-CCM+ 进行VOF（Volume-of-Fluid）与流体膜（Fluid-Film）耦合的多相CFD模拟，计算载片表面壁面剪切应力（Wall Shear Stress）及液滴冲击频率；以铜绿假单胞菌单菌种、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila BAA-74）-Vermamoeba vermiformis 及胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa IF6SW-F1）-铜绿假单胞菌为对象进行多界生物膜培养验证。

3. Results（结果）

3.1. Ruggedness assessment（稳健性评估）

通过对11组不同参数组合下铜绿假单胞菌生物膜密度的回归分析发现，进液流速显著影响对数密度（p < 0.0005），每提升1 mL/min平均密度增加0.57 log₁₀(CFU/cm²)，而旋转速率（10–50 RPM）与循环流速（9–27 mL/min）无显著影响（p ≥ 0.14），表明SOP对旋转与循环速率具稳健性，对进液流速不具稳健性。生物体积分析显示循环流速升高显著降低生物体积（p影响显著），尤以载片顶部（ROI 1）降幅最大（最高降43%），中部与底部递减，旋转与进液流速无显著影响，表明生物体积对循环流速变化敏感而对另两参数具稳健性。

3.2. SOP variance assessment（SOP方差评估）

三次SOP重复运行所得铜绿假单胞菌对数密度均值7.81 log₁₀(CFU/cm²)，重复性标准差SD_r= 0.11；生物体积均值4.78 log₁₀(μm³)，SD_r= 0.25。以九组独特因子水平模拟"假实验室（Faux Labs）"估算重现性，对数密度重现性标准差SD_R= 0.46，生物体积SD_R= 0.27，与ASTM标准化反应器（CDC、Drip Flow、MBEC）相当或更优。

3.3. Use case 1: Cooling tower MDB growth（应用案例1：冷却塔多界生物膜生长）

以异养菌预培基底物接种Vermamoeba vermiformis与Legionella pneumophila，三轮实验显示嗜肺军团菌密度4.53 ± 0.15 log₁₀(CFU/cm²)，混合异养菌9.00 ± — log₁₀(CFU/cm²)，SD_r均为0.15，证明ISBR可重复培养含病原菌的冷却塔典型多界生物膜。

3.4. Use case 2: Yeast-bacterial MDB growth（应用案例2：酵母-细菌多界生物膜生长）

先行建立Rhodotorula mucilaginosa菌丝膜5天后再接入Pseudomonas aeruginosa共培养至28天。真菌密度4.23–5.11 log₁₀(CFU/cm²)，细菌7.50–8.33 log₁₀(CFU/cm²)，各时间点均无显著群落漂移（p ≥ 0.7，除第二批次细菌第28天偶发下降），SD_r< 0.15（真菌）与< 0.35（细菌），CSLM证实两域共存，证明ISBR可稳定维持月尺度多界共培养。

3.5. Fluid film and shear stress model（液膜与剪切应力模型）

CFD模拟显示液滴撞击载片后形成主流液滴与残留液膜，稳态壁面剪切应力峰值约25 Pa集中于液滴前缘与接触线，非液滴区近0 Pa；平均剪切应力随液滴下落距离（即冲击位置从12°→6°）增大而升高（峰值约10–20 Pa），但同一位置不因循环流速改变而改变峰值，仅冲击频率升高（9 mL/min: 3.58 s^-1，18 mL/min: 7.25 s^-1，27 mL/min: 9.01 s^-1）。旋转速率对剪切应力影响可忽略，与实验稳健性结果吻合。

4. Discussion（讨论）与Conclusions（结论）

讨论指出ISBR的重复性（SD_r= 0.11 for log密度；0.25 for 生物体积）与估算重现性（SD_R= 0.46；0.27）与ASTM标准反应器相当，证明其可作为可靠研究平台。虽然对数密度对循环与旋转速率变化具鲁棒性，但生物体积受循环流速影响显著（更高频次局部剪切致更薄更致密结构而非 biomass 丢失），强调仅靠细胞密度不足以全面评估生物膜方法稳健性，须结合形态学（生物体积/CSLM）。CFD揭示ISBR具宽幅变动剪切（近0至25 Pa）及间歇润湿特征，近似真实冷却塔环境。多界生物膜案例证明ISBR可维持工程构建多界体系较长时间种群稳定，密度具高重复性。

结论：研究人员为新型ISBR制定了Pseudomonas aeruginosa生物膜生长SOP并验证其具优良重复性、预估重现性及对旋转与循环速率变化的稳健性（以对数密度为判据），但循环速率变化影响生物体积空间分布与厚度，凸显形态学评估之必要；CFD模型表明更高循环流速增加剪切事件频次而非峰值剪切应力。ISBR可重复培养Legionella pneumophila-Vermamoeba vermiformis冷却塔模型及Rhodotorula mucilaginosa-Pseudomonas aeruginosa酵母-细菌多界生物膜且种群超月稳定。本研究确立ISBR作为低剪切、高气体交换、间歇润湿环境下单菌种及多界生物膜培养的可靠平台。