综述：利用祖先序列重建技术来设计新型且性能稳健的酶

《Bioorganic Chemistry》：Harnessing ancestral sequence reconstruction for engineering novel and robust enzymes

　　

刘静怡|朱凯豪|宋友|唐功莉|何俊斌

沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，中国沈阳110016

摘要

生物催化已成为一种重要的绿色制造方法，能够在制药、农业和食品行业中实现可持续和高效的合成。除了在阐明分子进化方面的基础性意义外，祖先序列重建（ASR）也被证明是一种强大的技术，可用于设计具有增强性能或新功能的酶。ASR通过比较现有（当前）酶的序列来推断祖先的序列。这种方法具有高度的灵活性，不仅有助于生成活性更高、选择性更强或稳定性更好的酶，还为研究仅使用现代酶难以解决的基本机制和生化原理提供了独特的框架。本文综述了过去三年中ASR在多个领域的进展，包括调节酶的功能和选择性、探究功能分化机制、提高热稳定性和催化活性以及扩展底物范围。我们预计，ASR将在推动生物催化应用方面发挥越来越重要的作用。事实上，酶工程领域目前正在经历一个变革阶段，这一阶段得益于计算进化工具与实验验证的协同整合，这不断释放出生物催化剂的功能潜力。

引言

作为生物催化剂的酶具有精确的位点和立体选择性、高催化活性，并且能够在温和的反应条件下发挥作用[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。在制药、食品和农业行业中使用生物催化剂提供了一种可持续和绿色的方式，这与对环境友好型制造日益增长的需求相一致[6]、[7]。尽管这些是酶的固有优势，但天然酶的应用常常受到其有限活性和稳定性的限制。这一固有局限性促使人们开发酶工程技术，以适应工业需求[8]。

近年来，分子生物学和生物信息学取得了重大进展，蛋白质工程[9]、[10]、[11]、[12]、[13]已被证明是改善酶性能的有效方法。定向进化通过反复的突变和选择过程创造出具有增强性能的目标酶[14]、[15]、[16]。然而，这种方法通常需要高通量筛选，这往往耗时较长。相比之下，半理性设计[19]利用序列比对中的保守或可变位点来构建定向突变库。理性设计[17]、[18]则依赖于对酶的三维结构和催化机制的详细了解，以引入特定的、有针对性的氨基酸变化。鉴于这两种策略的局限性，高效地设计出具有所需性能的酶仍然具有挑战性。

利用祖先蛋白质的特性，祖先序列重建（ASR）作为一种替代且高效的方法出现在蛋白质工程中，用于获得具有增强活性或广谱性、稳定性强甚至新功能的酶[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]。ASR通过进化模型和系统发育分析从现有物种的序列中推断出古代蛋白质的序列[33]。通常，ASR过程包括六个主要步骤：收集现有物种的同源蛋白质序列、进行多序列比对、重建包含祖先节点的系统发育树、合成目标祖先基因序列、异源表达这些蛋白质，最后表征它们的生化功能。许多综述强调了ASR领域的显著进展。Elizabeth M. J. Gillam等人[34]概述了通过ASR推断和复活古代蛋白质的过程，这种方法不需要预先了解蛋白质的结构，并且通常能产生比现代同源物具有显著更高热稳定性的变体。他们还探讨了ASR过程及其关键影响因素，以及与传统理性设计和定向进化策略相比的优势和应用潜力。Colin J. Jackson等人[35]讨论了ASR在蛋白质工程中的潜力。Pimchai Chaiyen等人[36]总结了过去五年ASR的研究进展，指出重建的祖先可以作为具有显著提高的热稳定性、溶解性和表达产量的优质蛋白质支架。Andrea Mattevi等人[37]探讨了分析少数关键残基的变化如何解释复杂酶促特性的进化起源。总体而言，这种方法为设计坚固的工业级生物催化剂提供了有前景的策略。此外，ASR在揭示酶的催化机制[38]、结构进化[39]、[40]、[41]、[42]和功能分化[43]方面发挥着关键作用，为蛋白质设计提供了宝贵的见解。

在这篇综述中，我们重点关注了ASR的最新进展，特别是过去三年的进展。我们强调了其在酶工程中的广泛应用，特别是在生成改进或改变的功能特性方面，如调节底物广谱性和催化选择性，以及增强酶的基本特性，包括稳定性和催化活性。本文的主要目的是介绍这种开发新型生物催化剂的有效工具，从而扩大其在制药、农业和食品行业中的应用价值。

部分摘录

ASR在酶功能、广谱性和选择性工程中的应用

酶的进化和功能多样化在产生代谢产物中的结构复杂性和化学多样性方面起着关键作用。为了破译和利用这一进化过程，ASR已成为复活祖先酶的强大工具。这些祖先酶具有灵活的底物结合口袋和催化广谱性，为理性蛋白质工程提供了良好的起点[44]。在本节中，我们总结了ASR的应用

使用ASR生成热稳定性和高活性酶

虽然酶的稳定性和催化活性对于工业规模生产至关重要，但在现有酶中优化这些特性仍然是一个主要挑战。为了解决这一挑战，ASR通过复活通常表现出更好稳定性和更高催化活性的祖先酶，成为了一个有前景的解决方案。本节总结了ASR策略在改善这些关键酶特性方面的应用。已有许多研究成功设计了坚固的酶

ASR在酶工程中的局限性和挑战

尽管ASR已经显示出生成具有改进稳定性、催化活性甚至精细调节的广谱性和选择性的祖先酶的能力，但它仍然在多个方面面临重大挑战。

ASR作为一种序列生成工具，本质上依赖于输入序列的质量和组成，以及多序列比对的准确性。首先，序列收集是一个基本且关键的步骤。包含大量

讨论

我们已经证明，ASR是一个强大的平台，可以在多个维度上开发现有酶的多样化特性。ASR能够工程化酶的功能特性，例如调节底物广谱性和改变催化选择性[36]。通过追溯到关键的祖先节点，ASR可以复活在现代酶中减弱或丢失的催化活性。这种方法可以揭示潜在的功能——例如

CRediT作者贡献声明

刘静怡：撰写——原始草稿、方法论、概念化。朱凯豪：撰写——审阅与编辑。宋友：撰写——审阅与编辑、监督。唐功莉：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取。何俊斌：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。

资助

本工作部分得到了国家自然科学基金（22577146和22207117）、上海市科技重大项目以及中国科学院战略性先导科技专项（XDB1060000）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。