蛋白质组学分析揭示玻璃海鞘(Ciona intestinalis)变态发育过程中分子调控机制

《PLOS One》：Proteome analysis refines molecular processes underlying metamorphosis in the ascidian Ciona intestinalis

　　

被囊动物(Tunicata，含尾索动物Ascidiacea)是脊椎动物的真正姊妹类群(sister group)，正成为研究脊索动物幼虫及后幼虫发育(包括中枢神经系统(CNS)退化)的模式生物。海鞘幼虫具典型脊索动物体型，含背侧神经管。变态期间发生深层组织重组：部分组织退化，部分发育为成体功能结构；幼虫CNS亦退化，多数神经元消失以为成体CNS形成腾出空间。玻璃海鞘(Ciona intestinalis，下称Ciona)基因组已完成测序注释，鉴定出多个CNS特异性基因，使其适于研究生理性CNS退化的分子机制。为阐明Ciona变态的分子决定因子，研究人员分析了三个发育阶段——游动幼虫(SwL, Hotta 28期)、固着幼虫(SetL, Hotta 32期)和变态中幼虫(MetL, Hotta 34期)——的蛋白质组，经三阶段比较经质谱鉴定共405个差异调制蛋白(differentially modulated proteins)。富集分析与网络分析显示最显著涉及的生物学过程/通路包括自噬(autophagy)与mTOR信号通路、以及肌动蛋白细胞骨架(actin cytoskeleton)组织与重塑。本研究有助于阐明海鞘变态的分子过程，并为Ciona生理性神经退行(physiological neurodegeneration)机制提供新见解。

研究背景与目的

被囊动物(尤指海鞘Ascidians)是脊椎动物最近姊妹类群，其幼虫具典型脊索动物体制(含背侧中空神经管)，幼虫CNS由不足100个神经元和约250个胶质细胞组成。变态时幼虫尾、部分组织退化吸收，多数幼虫神经元(除少数运动神经元和谷氨酸能神经元外)消失，部分室管膜细胞分化形成成体CNS，是研究生理性神经退行(physiological neurodegeneration)的理想模型。Ciona基因组已测序注释，但变态过程的蛋白质组学研究稀缺。此前研究多集中于基因表达层面，对变态期间全蛋白动态变化及蛋白互作网络(protein-protein interaction, PPI)知之甚少。本文发表于《PLOS One》，研究人员通过比较Ciona三个变态关键阶段(SwL、SetL、MetL)的整体蛋白质组，鉴定差异表达蛋白(differentially expressed proteins, DEPs)，结合生物信息学分析揭示调控变态及生理性神经退行的分子通路与关键枢纽蛋白(hub proteins)。

主要关键技术方法

研究人员采集法国Roscoff海域采集的成年Ciona intestinalis，体外受精获得同步发育胚胎，于18°C人工海水培养至目标阶段：游动幼虫(Swimming larva, SwL, Hotta stage 28，孵化后约2 h)、固着幼虫(Settled larva, SetL, Hotta stage 32，尾吸收≥50%，孵化后10–11 h)、变态中幼虫(Metamorphosing larva, MetL, Hotta stage 34，柄部伸长旋转90°，孵化后14–18 h)；每阶段取200个个体为1个生物学重复，共3次独立受精实验(n=3生物学重复/阶段，SetL因技术原因舍去1个样本)。采用SDS裂解液超声提取总蛋白，FASP(Filter-aided sample preparation)酶解后，进行液相色谱-电喷雾串联质谱(LC–ESI–MS/MS, Orbitrap Fusion Tribrid)无标记定量(label-free quantification, LFQ)分析。搜库比对Ciona UniProt参考蛋白质组(UP000008144)，用MaxQuant做LFQ定量、Perseus做ANOVA+Tuckey事后检验(p<0.05)筛选DEPs，STRING做PPI网络(minimum required interaction score=0.7)与GO/KEGG富集分析，Cytoscape可视化；手动筛选具neuron/nerv注释及与Cao et al. 2019幼虫CNS单细胞转录组重叠的"神经元相关DEPs"。

研究结果

Proteomic analysis(蛋白质组学分析)

LC–ESI–MS/MS共鉴定1152个蛋白，其中405个在至少一对阶段比较中显著差异表达(ANOVA p<0.05，BH-FDR校正)。SetL vs SwL中上调70、下调152；MetL vs SetL上调124、下调100；MetL vs SwL上调74、下调154。35个蛋白在所有两两比较中均差异调制。结果表明定居阶段(SetL)具独特的蛋白质组特征，标志变态起始时发生大规模分子重编程。

Annotation of DE proteins(差异表达蛋白注释)

405个DEPs中283个获完整功能注释，99个按特征结构域(如VWFA、EF-hand、RRM、IF rod、Sushi域)归为"含某结构域蛋白"，23个完全未表征。结合STRING注释与Cao et al.单细胞转录组交叉比对，鉴定41个明确神经元DEPs，216个DEPs基因在游泳幼虫至少一种神经元亚型中表达，合计233个推定参与神经过程的DEPs，提示这些蛋白可能参与神经系统重塑。

Enrichment analysis(富集分析)

KEGG富集显示各比较共有"马达蛋白(Motor proteins)"、"氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)"、"脂肪酸降解(Fatty acid degradation)"、"氨基酸生物合成(Biosynthesis of amino acids)"。SetL vs SwL特异性富集自噬通路(Autophagy pathway，含ATG基因及MAPKs)、mTOR信号通路(mTOR signaling pathway)、蛋白酶体通路(Proteasome pathway)及乙醛酸/二羧酸代谢(Glyoxylate and dicarboxylate metabolism)。MetL vs SetL富集三羧酸循环(TCA cycle)、缬/亮/异亮氨酸降解、丙酸代谢及2-氧代羧酸代谢。MetL vs SwL富集部分氨基酸代谢及内吞作用(Endocytosis，含肌动蛋白细胞骨架组织相关蛋白)。GO-BP分析示SwL→SetL富集脂肪酸/脂质修饰及RNA/mRNA结合；SetL→MetL富集核苷酸/碳水化合物分解代谢及翻译调控；MetL vs SwL显著富集肌动蛋白细胞骨架(actin cytoskeleton)组织与重塑条目，表明变态早期启动自噬-蛋白酶体清除及骨架重构，后期转向能量代谢激活与胞吞-骨架重组为器官建成做准备。

Network analysis(PPI网络分析)

SetL-SwL比较得15个模块(community)，10个含≥3蛋白；模块4(翻译调控/rRNA代谢)与模块6(蛋白分解代谢)经神经元DEPs(eIF3b、eIF3e、Ubiquitin-ribosomal protein eS31融合蛋白r27a)连接，r27a亦为连接枢纽(connector hub)；模块2(细胞呼吸)、3(细胞黏附/运动)、10(蛋白磷酸化/应激响应)、14(染色体组织)也富含神经元DEPs。MetL-SetL网络识别出19簇，7簇互联，Glucose-6-phosphate isomerase和Tyrosine-tRNA ligase为枢纽连接糖代谢、脂肪酸氧化/呼吸与翻译/折叠模块；模块1富集发育与神经发生(neurogenesis)。整体变态(SwL→MetL)网络识别出转酮醇酶(Transketolase，TK，标注为神经元DEP)为核心枢纽，桥接碳水化合物代谢(模块16)、tRNA代谢(模块3)、细胞呼吸(模块5)及肌动蛋白细胞骨架组织(模块9，含F-actin-capping protein subunit β)；模块1(细胞黏附/神经发生)、3、6、9富含神经元DEPs。网络分析揭示多模块通过枢纽蛋白协同调控变态，Transketolase等蛋白同时关联能量代谢与神经相关过程。

讨论与结论翻译总结

研究人员指出本蛋白质组鉴定1152个蛋白(低于胚胎发育全长追踪研究)，归因于仅选取变态三阶段、Label-free定量策略及选用UniProt标准库而非更大自定义库，且样本为全幼虫匀浆可能掩盖CNS特异低丰度变化及部分未注释蛋白影响解读，但所得DEPs仍有效反映变态主控过程。Meta-2蛋白在SetL/MetL上调与已有转录组数据吻合，验证方法可靠性。Sushi域蛋白Ci-sushi(p-selectin)上调佐证其在尾退化中作用。SetL阶段自噬(autophagy)、泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)及mTOR信号显著上调，r27a为连接分解代谢与翻译模块的关键hub，提示自噬主导变态早期组织清除甚于凋亡(apoptosis)。肌动蛋白细胞骨架相关蛋白Cdc42(Rho GTPase家族，SwL→SetL上调后下调)、Capz(α/β亚基，全程下调，MetL-SwL网络hub)、Villin-1(SetL上调)共同驱动尾吸收依赖的肌动蛋白丝(actin filaments)重组。仅ERK(下调)和腺嘌呤核苷酸转运酶(ANT, Adenine nucleotide translocase，先下调后上调)等少数凋亡相关蛋白差异，与文献报道变态晚期自噬为主相符。若干DEPs(Annexin、Cdc42、GFAP、NADH dehydrogenase、Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase、Transketolase等)的人类同源物涉及阿尔茨海默病等神经退行病，暗示生理性神经退行与病理性神经退行可能存在保守分子基础。Transketolase作为枢纽连接多代谢与骨架模块，其失调关联硫胺素缺乏致氧化还原与神经发生受损。未表征蛋白所在社区含神经元富集提示可进一步挖掘新神经退行相关因子。综上，本研究通过无标记定量蛋白质组与PPI网络分析证实：自噬及mTOR通路激活、肌动蛋白细胞骨架重塑(actin cytoskeleton organization and remodeling)及细胞分化是Ciona intestinalis变态的核心驱动力，并鉴定出与脊椎动物神经退行疾病相关的候选分子，为理解脊索动物生理性CNS退化机制提供蛋白质组学依据。