《Crop Protection》：Establishment of GICA and RT-LAMP Detection Methods for Apple Stem Pitting Virus Infecting Pear Trees (Pyrus spp.)
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作者：Jing Sailing、Zhang Yubao、Jin Weijie、Wu Bumei、Qiu Yang、Ye Lin、Chen Jin、Zhao Xia、Li Yan
中国科学院西北生态环境资源研究院干旱地区生态安全与可持续发展国家重点实验室，中国兰州 730000
作者：Jing Sailing、Zhang Yubao、Jin Weijie、Wu Bumei、Qiu Yang、Ye Lin、Chen Jin、Zhao Xia、Li Yan
中国科学院西北生态环境资源研究院干旱地区生态安全与可持续发展国家重点实验室，中国兰州 730000
摘要
苹果茎凹陷病毒（ASPV）对全球苹果和梨产业构成了严重威胁；然而，目前的诊断方法依赖于实验室技术，这些方法耗时且不适合大规模的田间监测，因此迫切需要快速可靠的检测工具。在这项研究中，我们开发了两种优化的诊断平台来检测ASPV：一种是用于快速视觉检测的胶体金免疫层析法（GICA），另一种是用于敏感分子检测的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）法。GICA使用针对ASPV的优化多克隆抗体建立，而RT-LAMP法则采用了一组新设计的引物，针对ASPV外壳蛋白基因（cp）的保守区域。这两种方法对ASPV具有高特异性，不会与其他常见病毒发生交叉反应。GICA试纸可以在稀释至1:1000（10-3）的汁液中检测到ASPV，并在5分钟内提供结果。RT-LAMP法的灵敏度更高，检测限达到10-4，比传统的RT-PCR（10-2）高100倍。我们成功开发了一种快速的GICA试纸和一种高灵敏度的LAMP检测方法。我们提出了一种综合策略，将GICA试纸用于现场初步筛查，结合RT-LAMP法进行准确的实验室确认。这种两级方法为ASPV的流行病学监测和检疫检查提供了强大、高效且经济可行的解决方案，显著提高了现场疾病控制能力。
引言
“阮儿梨”是蔷薇科Pyrus ussuriensis Maxim.的一个关键品种，主要在中国甘肃省兰州市高兰县种植，也在河西走廊、陇中黄土高原和内蒙古自治区有分布。位于石川镇的“阮儿梨”种植区拥有可追溯到明朝的古老梨园系统。该梨园保持着“世界上最古老的梨园”的吉尼斯世界纪录，并于2025年10月被联合国粮食及农业组织（FAO）认定为全球重要农业遗产系统（GIAHS），占地面积约12,000亩。该区域内有9,423棵树龄超过100年的古老梨树，其中一些树龄超过400年。然而，由于管理不善和预防控制措施滞后，这些梨园经常发生病毒性疾病和其他病原体感染。经过近三年的田间调查以及分子检测和鉴定，研究团队确认ASPV是影响这些古老梨园的主要病毒病原体。
苹果茎凹陷病毒（ASPV）属于Foveavirus属（Betaflexiviridae科，Tymovirales目），在全球范围内感染多种苹果和梨品种（Cho等人，2016年；Wunsch等人，2025年）。ASPV感染具有隐蔽性，会导致一系列组织特异性症状，包括叶片叶脉黄化、果实出现石状凹陷以及木质组织出现深沟（Brakta等人，2015年；Lu等人，2018年；Ma等人，2016年；Mathioudakis等人，2021年）。这些症状严重损害了树木输送水分和养分的能力，最终降低果实品质并缩短受感染树木的寿命（图1）。因此，保护梨树和苹果树的关键在于有效的疾病管理——而这始于准确及时的病毒检测。
目前，ASPV的标准诊断方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）和逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）已经成熟（Costa等人，2022年；Lu等人，2018年）。虽然这些方法可靠，但它们本质上是基于实验室的，需要专门的设备、训练有素的人员以及相当长的时间来完成。这些限制使得它们不适用于大规模的流行病学监测、现场检疫检查或现场的快速决策，成为有效疾病控制的关键瓶颈。
为了克服这些限制，迫切需要快速、灵敏且可在现场使用的诊断工具。近年来，两种技术作为有前景的解决方案出现：胶体金免疫层析法（GICA）和逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）。GICA是一种侧向流动检测方法，可在5分钟内无需仪器即可进行视觉检测，非常适合现场筛查（Kong等人，2025年；Lu等人，2025年）。RT-LAMP提供了一种分子检测方法，结合了高灵敏度和等温扩增的优势，无需热循环仪。虽然GICA非常快速，但在病毒滴度较低的样本中其灵敏度可能有限；相反，RT-LAMP具有更高的灵敏度，但需要基本的样本处理，并且如果处理不当存在气溶胶污染的风险（Caruso等人，2023年；Silva等人，2024年；Varela de Andrade等人，2024年）。本研究建立的LAMP和GICA系统均为ASPV的现场检测提供了灵敏、快速且无需仪器的解决方案，适用于检疫检查和紧急疫情响应。
因此，本研究旨在通过开发和优化GICA和RT-LAMP检测方法来填补ASPV诊断方面的空白。通过利用每种技术的独特优势，我们提出了一种综合的“现场筛查和实验室确认”策略。这种方法结合了GICA的快速便携性和RT-LAMP的高灵敏度，为珍贵梨树种质的监测和管理提供了强大、实用且高效的解决方案。
章节片段
病毒分离和RNA提取
从中国甘肃省高兰县收集了植物样本，包括健康和感染ASPV的Pyrus ussuriensis样本。用于特异性测试的病毒分离株详见表1。使用FastPure? Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme Biotech Co., Ltd., 南京）按照制造商的协议从100毫克植物组织中提取总RNA。随后使用Revert Aid Master Mix（Thermo Fisher）合成第一链cDNA
ASPV CP的克隆、表达和纯化
转化菌落使用ASPV cp特异性引物（ASPV-CP）进行PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳分析显示约1.2 kb处有一个特异性条带（图S1 A），与预期的ASPV cp片段大小一致。测序结果确认插入的片段包含完整的开放阅读框，没有碱基缺失或移码突变，与目标序列100%相同。这些结果证明了成功的
讨论
在广阔的果园和珍贵种质资源中管理ASPV需要平衡现场快速性和实验室精确性。我们开发了两种互补的平台：一种无需仪器的GICA试纸和一种高灵敏度的RT-LAMP检测方法。与传统的DAS-ELISA相比，后者需要1-2天时间和专用设备，成本较高，不适合大规模筛查；而标准RT-PCR则依赖于严格的RNA提取、精密的热循环设备和后续的凝胶电泳
结论
本研究建立了一个双平台诊断框架，弥合了快速现场监测和严格实验室确认之间的操作差距。无需提取的GICA试纸可以在10-3稀释度下立即进行现场分类，而RT-LAMP检测方法则确保了在10-4稀释度下的稳健分子验证——比传统RT-PCR提高了100倍。除了特定检测方法的优化外，
CRediT作者贡献声明
Jin Chen：验证、资金获取、数据管理。Lin Ye：验证、正式分析、数据管理。Yang Qiu：验证、数据管理。Bumei Wu：验证、数据管理。Weijie Jin：数据管理。Yubao Zhang：写作——审稿与编辑、写作——初稿、可视化、验证、资源获取、调查、数据管理。Sailing Jing：写作——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。Yan Li：数据管理。Xia Zhao：
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：32572850）、中国科学院青年学者区域发展项目（项目编号：2022-01）、甘肃省知识产权项目（项目编号：23ZSCQ030）、兰州市城关区科技计划项目（2024RCCX0008）和高兰县科技计划项目（项目编号：2023-7）的资助。
