高通量SWCNT NIR-II光谱技术实现细胞和体内应用

《ACS Nanoscience Au》：High-Throughput SWCNT NIR-II Spectroscopy Enables Cell and In Vivo Applications

　　

诊断传感器的开发和临床转化滞后，部分原因是缺乏快速、高通量的筛选方法。优化高通量传感器开发与部署有望加速工具向临床的转化。为解决这一问题，研究人员使用连接外部探头的近红外（NIR-II）微孔板读数仪优化了高通量筛选参数，用于体内测试。研究人员评估了光谱参数，以提高基于单壁碳纳米管（SWCNT）的光学传感器的筛选速度和精度。为此，研究人员评估了合适的微孔板规格，包括激光功率、激发波长、曝光时间和焦距高度参数，用于SWCNT光学传感器的开发。研究人员还使用微孔板读数仪筛选了被巨噬细胞系内吞的荧光SWCNT。随后，研究人员进行了NIR探头光谱分析，评估包埋于甲基纤维素水凝胶中的SWCNT。最后，研究人员使用NIR探头测量了活体免疫活性小鼠体内SWCNT的中心波长和强度。研究人员预计该框架可广泛用于近红外纳米传感器的开发，并具有加速临床诊断转化的潜力。

# 论文解读：高通量SWCNT NIR-II光谱技术实现细胞和体内应用

## 研究背景与问题

近红外（NIR）光谱学在生物医学应用中具有重要价值，包括无创深组织成像和生物流体样本的无损化学分析。然而，传统的临床诊断方法存在劳动强度大、耗时长、成本高等显著缺点。MRI、CT和PET等成像方式存在时间分辨率低、电离辐射暴露、不适用于即时或床边诊断等缺陷。NIR-II（短波红外，SWIR）波段（1000–1700 nm）被称作生物组织透明窗口，具有高组织穿透深度、低水与光子吸收、低组织自发荧光和光散射等优势。但多数情况下需要NIR荧光团来转导信息。现有的NIR荧光探针（如NIR-I有机染料、量子点、稀土掺杂纳米颗粒、工程化荧光蛋白）存在光漂白、快速降解、体内非特异性摄取或量子产率低等问题。单壁碳纳米管（SWCNT）凭借其光稳定性、非光漂白性、大斯托克斯位移及对周围电化学环境的敏感性，在NIR-II荧光传感领域展现出巨大潜力。然而，这类纳米传感器的开发需要高通量筛选平台，而市售的高通量仪器多针对可见光荧光团，针对NIR荧光团的系统尚处于起步阶段。此外，为了实现疾病生物学研究与转化传感器开发，体内部署和验证必不可少。因此，研究人员旨在优化基于微孔板读数仪的高通量NIR-II光谱参数，并建立从溶液、细胞到活体的集成工作流程，以加速传感器开发与临床转化。该论文发表在《ACS Nanoscience Au》。

## 主要技术方法

研究人员使用了ClaIR NIR-II微孔板读数仪（Photon etc.，蒙特利尔，加拿大）及配套的IRina点射式光谱探头，该系统配备655 nm和730 nm二极管激光器。研究中采用了HiPCo法制备的SWCNT，经脱氧胆酸钠（DOC）或单链DNA（ssDNA）分散后用于光谱分析。在活体实验中，选用3只4–6周龄无毛免疫活性SKH1-Hrhr雌性小鼠，皮下注射（GT）₁₅-SWCNT悬液，在不同时间点通过光谱探头采集荧光光谱。所有光谱数据通过伪Voigt峰拟合进行中心波长和最大强度分析，拟合优度R2>0.99视为有效。

## 研究结果

### SWCNT Spectral Analysis（SWCNT光谱分析）

研究人员使用高通量NIR-II微孔板读数仪获得了DOC-SWCNT的代表性吸收和荧光光谱。吸收光谱在1150 nm和1250 nm处显示特征峰；荧光光谱在655 nm和730 nm激发下分别显示(7,6)、(7,5)、(9,4)手性SWCNT的特征发射峰（1040、1137、1129 nm）。与单比色皿仪器对比，微孔板读数仪在NIR-II范围内吸收信号约高2倍，荧光光谱虽因激发波长差异略有偏移，但信噪比无显著差异。高通量采集96个样品仅需约5分钟（自动），而单比色皿仪器需要近50分钟的手动操作。

### Well Plate Evaluation to Reduce Intraplate Variability（降低板内变异性的微孔板评估）

研究人员测试了五种商用微孔板（Corning半区96孔UV透明板、Brandtech 96孔、Corning 384孔、Brandtech 384孔、Corning 1536孔），比较中心波长和强度方差。Corning半区96孔UV透明板在(7,5)和(8,6) SWCNT中表现出最低最大方差（0.098 nm）。单通道与多通道移液器、擦拭板底等操作对信号无统计学显著影响。因此推荐Corning半区96孔UV透明板用于NIR-II高通量测量。

### Excitation Parameters for High-Throughput Spectroscopy（高通量光谱的激发参数优化）

研究人员优化了曝光时间、激光功率和信号采集模式。对于吸收光谱，可见光区域宜用1–10 ms低曝光时间以避免过饱和，NIR区域宜用50–250 ms。对于荧光光谱，曝光时间125–500 ms可获稳定中心波长和低均方根误差（RMSE）；激光功率在1500 mW以上可获得更亮的信号，但需避免(7,6)峰在655 nm激发下过饱和。2×1数据分箱（binning）会降低数据点数，不推荐用于SWCNT；高增益模式在强信号样品中引入噪声，适用于低信号样品。

### NIR-II Fluorescence Analysis of SWCNTs Endocytosed by Macrophages（巨噬细胞内吞SWCNT的NIR-II荧光分析）

研究人员将(GT)₁₅-ssDNA-SWCNT加入RAW 264.7小鼠巨噬细胞（12个生物学重复）中孵育30分钟，使用高通量微孔板读数仪采集荧光光谱。结果显示在1100–1400 nm范围内获得了清晰的特征发射峰，而短波区域变异较大。调整激光焦距（0–1 mm）对信号影响极小，表明巨噬细胞始终处于激发束腰内。该方法可实现快速筛选巨噬细胞表型相关的SWCNT传感器信号，有望促进高通量药物筛选或炎症疾病生物学研究。

### Assessment of Hydrogel-Encapsulated SWCNTs Using a Spectroscopic Probe Attachment（使用光谱探头评估水凝胶包埋的SWCNT）

研究人员将(GT)₁₅-SWCNT包埋于甲基纤维素水凝胶中（每样3个孔，每孔6次采集），采用NIR探头光谱分析。发现激光功率超过1000 mW时水凝胶出现熔化迹象（浑浊和不均匀），因此最大功率设为1000 mW。随曝光时间和激光功率增加，荧光峰变窄、峰中心波长标准差下降，但强度标准差上升。室内荧光灯对测量无显著影响。分箱和高增益模式在该系统中未改善信号。

### SWCNT Spectral Analysis in Live Mice（活体小鼠SWCNT光谱分析）

研究人员在无毛免疫活性SKH1-Hrhr小鼠皮下注射(GT)₁₅-SWCNT，立即及1、4、24小时后使用光谱探头采集荧光光谱（激光功率1000 mW，曝光1000 ms）。在注射部位各时间点均检测到特征SWCNT荧光信号。24小时后不同小鼠间的信号异质性增加（可能源于注射深度、细胞摄取、组织转运或生物分子相互作用差异），也受探头放置高度和角度影响。尽管如此，研究证实了可在一天内收集自由注射的SWCNT传感器信号，并实现从先导传感器到临床前模型测试的转化。

## 总结与结论翻译

讨论部分指出，本研究建立了从溶液、巨噬细胞到水凝胶固定及活体小鼠的集成高通量筛选与测试工作流程，并提供了各使用场景的推荐参数。这类方法有望加速体外和体内诊断设备的开发。局限性包括：巨噬细胞实验中存在的噪声（取决于SWCNT内吞量和量子产率）；活体实验中因激光探头放置位置导致的变异性（可通过定制掩膜标准化高度和角度来改进）。未来需利用该框架从大量潜在传感器中筛选出几个候选并最终获得临床前先导，可能需借助机器学习处理大数据集。

**结论翻译**：在这项工作中，研究人员使用微孔板读数仪评估了SWCNT NIR-II传感器在溶液和巨噬细胞内吞后的高通量光谱，随后评估了这些传感器在水凝胶固定及小鼠皮下注射后的快速数据采集。研究人员为高通量微孔板读数仪和光学探头装置提供了各使用场景的建议参数。这种集成的筛选和测试方法预示了快速开发体外和体内诊断设备的可能性。研究使用模型NIR荧光团——单壁碳纳米管（在溶液、细胞和小鼠中显示稳定、明亮的荧光）进行了验证。然而，对于其他SWCNT配方或其他NIR荧光团，可能需要根据其量子产率和发射光谱进行额外优化。另一个局限性是巨噬细胞体外实验中观察到的噪声，这取决于总SWCNT内吞量和量子产率，不同荧光团配方和细胞系会有差异。此外，活体中因激光探头放置导致的变异性可通过定制打印掩膜来标准化动物放置的高度和角度加以解决。在本工作中，研究人员优化并验证了一个加速临床前先导开发与测试的流程框架。然而，未来工作必须利用此框架，从大量潜在传感器库中推进到几个候选传感器，并最终获得临床前先导。可能需要机器学习来整合和处理获得的大数据集。通过结合细胞系和动物模型测试，快速开发针对多种疾病状态（从慢性炎症疾病、癌症到药理学分析）的新型传感器和诊断工具具有巨大潜力。下一代研究工具和临床诊断需要更高的通量、更多的数据和更快速的优化，本研究正是朝着这一目标迈进。