犬认知功能障碍综合征(CCD)中神经毒性胶质增生和血脑屏障失调增加

《Frontiers in Aging》：Increased neurotoxic gliosis and blood-brain barrier dysregulation in canine cognitive dysfunction syndrome (CCD)

　　

摘要
背景：随着阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)及相关痴呆症(Alzheimer’s Disease and Related Dementias, ADRD)的患病率预计到2050年将翻倍，对其病理学研究的相关模型的迫切性日益增加。衰老是AD发展的主要风险因素，并受到多种因素的影响，包括神经毒性胶质细胞激活和血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)降解；然而，历史上AD模型主要由转基因小鼠体内和体外方法组成。尽管这提供了许多优势，但其模拟衰老诱导的AD病理的能力有限。目前，研究人员正在研究犬认知功能障碍(Canine Cognitive Dysfunction, CCD)综合征，因为它是一种自然发生的自发性疾病，具有与AD和其他痴呆症相似的病理特征。研究人员的实验室和许多其他实验室已广泛致力于表征CCD病理学。然而，小胶质细胞和星形胶质细胞激活的作用以及血脑屏障(BBB)之间的相互作用尚未被研究。本研究旨在填补CCD以及其与人类AD关系中这一知识空白。研究人员假设，患有CCD的犬将表现出增强的神经毒性胶质细胞激活和BBB降解。
方法/结果：研究人员利用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)、形态学分析和免疫荧光技术，比较了CCD阴性(CCD negative)和CCD阳性(CCD positive)犬的CCD病理学。在本研究中，研究人员观察到与CCD阴性犬相比，CCD阳性犬中胶质细胞形态与神经退行性疾病中观察到的神经毒性胶质细胞一致，S100β/C3星形胶质细胞激活增加，claudin-5表达降低，以及区域依赖性的血管周围AQP4表达调节。
结论：研究人员的实验进一步表征了CCD发病机制中胶质细胞和BBB的作用，并强化了在衰老犬中模拟AD/ADRD的优势。

**犬认知功能障碍综合征(CCD)中神经毒性胶质增生与血脑屏障失调的研究解读**

### 研究背景与问题

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)及相关痴呆症(Alzheimer’s Disease and Related Dementias, ADRD)是与年龄相关的神经退行性疾病，其特征为进行性认知障碍，目前影响超过700万美国人，且病例预计到2050年将翻倍。Aβ(amyloid beta)斑块和过度磷酸化tau蛋白缠结的积累构成了AD的经典神经病理学标志，但针对这些靶点的治疗干预在患者结果中尚未获得一致效果，因此研究人员开始探索可能同时参与ADRD发病机制的其他细胞应激通路。越来越多的证据表明，神经炎症在多神经退行性疾病中扮演重要角色，尤其是在AD中，神经炎症与Aβ斑块和tau蛋白缠结的增加同时发生。

神经炎症由胶质细胞调节，特别是小胶质细胞和星形胶质细胞，它们表现出对不同生理和病理刺激的显著表型可塑性，产生从神经保护到神经毒性的功能结果。在正常条件下，小胶质细胞呈小胞体和高度分支突起；而在病理应激如衰老或缺血时，小胶质细胞转变为神经毒性表型，呈现变形虫样形态、胞体增大和分支减少。星形胶质细胞在损伤和疾病中也经历表型重塑，神经保护性星形胶质细胞通常呈现肥大性重塑（面积、分支数和复杂性增加），而神经退行性疾病中则表达下调。激活的星形胶质细胞上调GFAP(glial fibrillary protein)、S100β(S100 calcium-binding protein beta)和C3(complement component 3)的表达，其共定位是激活状态的常见特征。

慢性神经炎症还导致神经保护性血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)的功能障碍。BBB由脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)、周细胞和星形胶质细胞构成，BMECs表达多种紧密连接蛋白，其中claudin-5是主要蛋白，限制小于800 Da的分子旁细胞扩散。此外，星形胶质细胞终足通过AQP4(aquaporin-4)通道调节水运输。claudin-5、AQP4和胶原IV的失调均与BBB功能障碍和痴呆相关。

尽管神经炎症和BBB失调与ADRD病理学存在明确关联，但当前研究模型（如转基因小鼠）存在局限性，特别是在自然衰老和环境因素方面，这些因素与ADRD风险增加相关但被忽略。衰老是ADRD最大的已知风险因素，这造成了实验室啮齿动物模型向人类ADRD发病机制转化的重要缺口。犬因其自然自发性发展出与人类ADRD高度相似的犬认知功能障碍(Canine Cognitive Dysfunction, CCD)综合征，而被越来越多地评估为ADRD模型。先前研究显示，老年犬与年轻犬相比，促炎性小胶质细胞激活、神经毒性星形胶质细胞激活、Aβ斑块和神经原纤维缠结显著增加，但尚未在临床诊断为CCD的老年犬中研究胶质细胞、神经炎症与BBB调节之间的复杂相互作用。因此，本研究旨在填补这一知识空白。

### 研究目的与假设

研究人员假设，通过主人调查和Aβ斑块积累确认患有CCD的犬，将表现出向神经毒性胶质细胞、神经炎症和BBB失调的表型转变增加。这些因素与斑块和神经原纤维缠结积累共同导致神经退行性变和随后的CCD发展。该研究发表在《Frontiers in Aging》。

### 主要技术方法（<250字）

本研究使用了来自科罗拉多州立大学(Colorado State University)兽医教学医院的私人饲养犬只（经主人同意后 euthanasia）脑组织样本。CCD状态通过主人调查的犬痴呆量表(Canine Dementia Scale, CADES)评分和Aβ病理学确认。主要方法包括：
1. 免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)：使用抗Iba1(ionized calcium-binding adapter molecule 1)和抗GFAP抗体标记小胶质细胞和星形胶质细胞，用于形态学分析。
2. 骨化分析(Skeletonization analysis)：在20x图像中随机选择10个Iba1+小胶质细胞和GFAP+星形胶质细胞，使用ImageJ插件计算细胞面积、胞体面积、圆度、分形维数（复杂性的分形维度）、分支数和分支长度总和。
3. 免疫荧光(Immunofluorescence, IF)：使用多重标记评估星形胶质细胞激活（S100β/C3共表达）、BBB完整性（claudin-5、胶原IV、AQP4）。血管周围AQP4表达通过围绕血管绘制ROI(region of interest)并测量平均灰度强度。

### 研究结果

**微胶质细胞和星形胶质细胞在CCD+犬中采纳神经毒性表型形态**
通过IHC和形态学分析，CCD+犬与CCD-犬相比，皮层微胶质细胞面积减小、胞体面积和圆度增加、分形复杂度、分支数和分支长度总和降低；海马区呈现相似模式。CCD+犬的皮层星形胶质细胞面积、胞体面积、复杂度、分支数和分支长度总和降低，胞体圆度增加；海马区星形胶质细胞面积、分支数和分支长度总和降低，复杂度降低，胞体圆度增加但胞体面积无显著变化。这些变化一致表明CCD+犬中神经毒性胶质表型的增加。

**神经毒性S100β+C3+星形胶质细胞和C3表达在CCD+犬的皮层和海马中增加**
通过S100β/C3免疫荧光共标染色，CCD+犬在皮层和海马中S100β+星形胶质细胞共表达C3的比例显著升高，C3在S100β+星形胶质细胞中的平均灰度强度也显著增加，说明神经毒性星形胶质细胞激活增强。

**CCD+犬中血管周围AQP4表达呈差异改变**
总AQP4表达在皮层和海马中CCD+与CCD-犬之间无显著差异；然而，血管周围AQP4表达在皮层中显著降低，在海马中显著升高，表明AQP4在CCD+犬中发生区域特异性定位调节。

**CCD+犬皮层和海马神经血管中claudin-5表达下调**
claudin-5免疫荧光显示CCD-犬中claudin-5连续且紧密连接微血管，CCD+犬则显示降低且不连续的强度。定量分析证实皮层claudin-5表达降低30.0%，海马降低35.7%，提示紧密连接完整性受损。

**CCD+犬中基底膜胶原IV表达保持**
胶原IV表达在皮层和海马中CCD+与CCD-犬之间无显著差异，表明尽管内皮和星形胶质细胞改变，基底膜结构仍保存。

### 讨论与结论总结

讨论部分指出，CCD与胶质细胞重塑和BBB改变相关，反映了功能失调。CCD+犬表现出增加的神经毒性星形胶质细胞激活和小胶质细胞形态反应性，伴随内皮紧密连接蛋白claudin-5的破坏和区域特异性的血管周围AQP4改变，而基底膜胶原IV表达保持。这些发现与人类AD神经病理学研究中观察到的特征一致，支持CCD作为研究年龄相关BBB功能障碍和神经炎症的生理相关模型的转化价值。局限性包括：形态学分析中GFAP仅显示15%的星形胶质细胞形态；未直接评估BBB通透性；未研究其他紧密连接蛋白如zonula occludens、occludin和PECAM-1。

**研究结论部分翻译**：
总之，研究数据确定了选择性BBB成分破坏、胶质增生和星形胶质细胞终足重塑为CCD的关键特征。尽管这只是衰老犬的一个小子集，这些显著发现表明，犬的年龄相关认知功能障碍以胶质-内皮功能障碍驱动的神经血管单元调节为特征。然而，其机制复杂性仍不清楚，需要进一步研究。