综述：细胞外囊泡信号在围术期神经认知障碍中的作用

《Frontiers in Immunology》：Extracellular vesicle signalling in perioperative neurocognitive disorders

　　

围术期神经认知障碍（Perioperative Neurocognitive Disorders, PND）涵盖术后谵妄、延迟神经认知恢复及术后神经认知障碍，是老年及脆弱手术人群的重要并发症，与住院时间延长、功能恢复下降、医疗资源消耗增加及远期预后恶化密切相关。现有证据表明，PND并非单一机制驱动，系统性炎症、神经血管功能障碍、血脑屏障损伤、胶质细胞活化、先天免疫信号及突触损伤均参与其中，但外周围术期应激如何转化为持续性术后脑功能障碍的具体通路仍不明确。细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为携带蛋白质、脂质及核酸的脂质双层封闭颗粒，参与细胞间及器官间通讯，可能为手术损伤与下游脑反应之间的机制关联提供解释。新兴研究显示，EV相关信号可能介导从外周炎症及血管应激到血脑屏障功能障碍、神经炎症、补体相关突触损伤及神经元功能障碍的进展过程。同时，EV携带的货物可作为围术期研究中具有生物学信息价值的外周信号。本综述系统阐述了EV信号的生物学基础、EV研究相关的核心方法学问题，以及目前将EV相关信号与PND联系起来的临床与实验证据，并探讨了来源特异性EV群体与围术期脑损伤的潜在相关性。

1 引言

围术期神经认知障碍（PND）是一类异质性较高的临床综合征，包含术后谵妄、延迟神经认知恢复及术后神经认知障碍，三者在临床表现、评估窗口及潜在生物学机制上存在差异。此类疾病主要集中于老年及脆弱手术人群，与不良预后密切相关。既往单一病因模型已被摒弃，当前研究支持系统性炎症、血脑屏障损伤、胶质细胞活化、神经递质失调、补体相关突触损伤及年龄相关脑易感性等多重相互作用机制。然而，以系统性为主的围术期损伤如何转化为脑内持续且空间有序的信号传递，仍是尚未明确的核心科学问题。

细胞外囊泡（EVs）为这一缺失环节提供了合理的解释框架。EVs并非替代已确立的外周?脑信号通路，而是为其增加了一个新的信号层级。几乎所有细胞类型均可释放膜结合颗粒，其携带的蛋白质、脂质及核酸能够反映供体细胞生理或病理状态。EVs的意义不仅在于货物多样性，还体现在其可保护体液中的不稳定分子、到达远端组织并改变受体细胞表型。与游离可溶性介质相比，同一EV群体可包装多类生物信息，并能部分保留释放细胞的活化状态及可能的细胞来源信息。在神经系统疾病中，EVs日益被视为脑?外周通讯的介质而非细胞损伤的被动副产物，这一视角对PND尤为重要，因为它可在单一信号模型中连接外周组织损伤、血管界面功能障碍、先天免疫活化及继发性神经损伤。

目前围术期领域的特异性证据正在积累。临床研究已将围术期EV货物（包括EV相关microRNAs、蛋白质、代谢物及补体相关信号）与术后谵妄或不良术后神经认知结局相关联。实验研究进一步表明，术后或细胞来源的EVs可在动物模型中影响神经炎症与认知功能。结合近期《British Journal of Anaesthesia》社论对EV信号在术后神经认知功能障碍中相关性的强调，这些发现支持EVs成为PND研究的新兴方向。本综述围绕EV信号在PND中的作用展开，重点讨论其生物学基础、与已确立的外周?脑信号机制的关系、生物标志物价值、对疾病机制的贡献及转化前景。

2 PND的临床表型与围术期背景

PND在临床上是异质性的，而非单一的术后脑综合征。根据现行命名，其谱系包括术后谵妄、延迟神经认知恢复及术后神经认知障碍，三者临床表现、评估时间及潜在生物学机制不同。术后谵妄通常为早期、急性、波动性综合征，而延迟神经认知恢复及术后神经认知障碍则指术后较晚时段检测到的更持续性认知下降。这一区分在临床与研究中均具有重要意义，因为术前、术后即刻或术后数周至数月发现的认知变化并不一定代表相同的生物学过程。围术期环境进一步增加了异质性：高龄、衰弱、基线认知易损性、血管合并症及既存低度系统性炎症均与术后谵妄或更广泛PND表型的易感性升高相关。同时，手术带来的生物学负荷并不一致，心脏手术、大骨科手术、脊柱手术及其他重大手术在组织损伤程度、血流动力学扰动、输血暴露及炎症活化程度上存在差异，均可能影响术后循环信号的时机、幅度及解读。因此，该领域的研究结果应在表型定义明确、考虑时间因素及手术特异性的框架内进行解释，而非泛化至所有围术期认知结局。

当前PND研究主要聚焦于两大类循环信号。一类为炎症介质，如C反应蛋白（CRP）、IL?6、TNF?α及相关细胞因子网络，常用于反映手术相关的系统性炎症反应及谵妄风险。另一类则与神经、胶质或神经血管损伤相关，如神经丝轻链（neurofilament light）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）及血脑屏障功能障碍指标，可能更好地反映围术期脑易损性及持续组织应激。尽管这些方法推进了对PND的理解，但大多数可溶性标志物仅能捕捉复杂的围术期反应的单一层面，并受到采样时间、手术强度及基线合并症的显著影响。在此背景下，细胞外囊泡尤其值得关注，因为它们可能提供更整合的信号，并有助于解释系统性围术期应激如何转化为神经血管损伤、胶质细胞活化及神经元功能障碍。

3 细胞外囊泡信号的生物学基础

3.1 细胞外囊泡的生物学

细胞外囊泡（EVs）是目前首选的通用术语，指由细胞衍生、由脂质双层包裹且无复制能力的颗粒。在大多数实验环境中，分离得到的囊泡无法确切归属单一生物合成途径。广义而言，小EVs通常与内体系统相关，而较大囊泡更多通过质膜向外出芽产生。EV释放并非膜周转的随机副产物，而是受细胞类型、细胞状态及局部条件（如炎症、缺氧、代谢应激及组织损伤）的影响。EV生物学的另一核心特征是，其货物是有选择性地组织的，而非被动继承供体细胞的成分。EVs可包含蛋白质、脂质、代谢物、DNA、mRNA、microRNAs及其他非编码RNA，但其组成并不简单反映细胞内环境。货物的纳入受分选机制、膜结构域、RNA结合蛋白及释放细胞生理状态的调控，这解释了为何EV群体在不同组织及病理背景下存在差异。这种选择性包装是EVs被视为具有功能意义的信号颗粒而非惰性细胞碎片的重要原因之一。

释放后，EVs可通过多种途径影响受体细胞：部分通过细胞表面配体?受体相互作用发挥作用，另一些则通过内吞、吞噬、巨胞饮或在某些情况下直接膜融合被内化。其生物学效应不仅取决于细胞摄取，还与细胞内运输及功能性货物是否成功在受体细胞内释放有关。在中枢神经系统中，EVs参与神经元、胶质细胞及血管细胞间的通讯，并日益被认为参与脑与外周之间的信号传递。尽管EVs可与血脑屏障相互作用，并在某些条件下可能穿过血脑屏障，但直接证明体内一致双向转运的证据仍然有限，且潜在机制在不同模型及炎症状态下存在差异。在PND背景下，核心问题不仅是循环EVs的存在，而是围术期EV释放及货物的变化是否足以以生物学意义显著的方式影响神经血管、胶质或神经元功能。

3.2 细胞外囊泡研究的方法学考量

EV研究的第一个挑战在于分类本身具有操作依赖性而非绝对性。现行指南建议使用“细胞外囊泡”作为通用术语，并在无法直接证明生物发生的情况下，根据可测量特征（如大小、密度、分子组成或细胞来源）对囊泡进行描述。实践中，研究者常将小EVs与中/大EVs区分，并可能使用外泌体、微囊泡或凋亡小体等术语，但这些标签不可互换，且并不总是有实验数据支持。小EVs通常富集内体来源的囊泡，而较大囊泡更多源于质膜出芽；但分离后的样本通常包含异质性且重叠的群体，而非单一纯亚型。这一点对结果解读具有直接影响：研究间差异可能反映的是不同EV组分的富集程度，而非真实的生物学分歧。因此，MISEV2023及近期《Nature Reviews Methods Primers》文章均强调，EV制备应基于方法学精确性进行描述，而不能仅凭术语假定特定囊泡身份。

第二个问题在于分离与表征。没有任何单一方法对所有生物体液或下游应用都是最优的。超速离心、尺寸排阻色谱、密度梯度、聚合物沉淀、亲和捕获及微流控平台在产率、纯度、可扩展性和亚型偏倚方面存在显著差异。因此，仅凭颗粒计数、蛋白浓度或少数常规标志物的检测结果不足以确立EV身份或样本质量。这些局限性在血液来源的EV研究中尤为突出，而血液研究对PND至关重要。血液中富含脂蛋白、蛋白复合物、残留血小板及细胞碎片，其在大小和组成上与EVs重叠，使得完全纯化不切实际。MIBlood?EV声明强调，分析前变量（如抗凝剂选择、处理时间、离心步骤、储存条件及冻融循环）是决定数据质量的主要因素。一个特别重要的混杂因素是体外血小板活化。比较研究显示，血清来源的EV组分比血浆来源的EV组分含有更多颗粒，并富集血小板相关蛋白，表明凝血过程本身即可重塑所测囊泡池。同样，脂蛋白污染会扭曲蛋白质组学与功能分析结果，近期研究表明基于密度的脂蛋白去除可显著改善血浆EV读数。在围术期研究中，凝血、血液稀释、炎症、输血及组织损伤均处于动态变化，这些技术变量的影响可能更为显著。解读上的问题还延伸至分离之后。批量循环EV制备很少能可靠确定组织或细胞来源，许多工作流程仅富集囊泡谱的一部分。因此，EV货物的变化不一定意味着某一明确生物学群体的真实变化。功能研究中同样需要谨慎：摄取实验可能受染料伪影、聚集或非特异性吸附影响，且囊泡内化证据本身并不能证明发生了具有生物学意义的货物转移。现行建议强调正交表征、适当的阴性与过程对照，以及在可能情况下进行扰动实验，以区分EV依赖效应与共同分离的非囊泡物质引起的效应。透明报告同样至关重要，EV?TRACK的建立旨在提高整个领域的方法学透明度与可重复性，其基本原理对转化工作具有重要参考价值。在PND领域，临床研究数量有限且多为小队列，技术与解读上的严谨性尤为重要，否则分析前噪声与成分模糊可能被误认为机制性洞见。

4 细胞外囊泡作为PND的生物标志物

4.1 循环细胞外囊泡与围术期风险分层

风险分层是EV类生物标志物在PND中最直接的临床应用切入点。当前临床实践中，围术期认知风险仍主要依据人口统计学及临床特征（如高龄、衰弱、既存认知障碍、合并症负担及手术应激）进行评估。这些变量仍有价值，但无法直接反映大脑对围术期损伤的生物学易感性。近期以生物标志物为重点的综述强调，需要分子工具补充常规临床评估，以便在明显的术后认知表现出现之前识别易感患者。观察性数据显示，术前衰弱与认知障碍与术后谵妄相关，但二者单独预测效能有限，仍需更广泛的整合模型。同时，术前低度系统性炎症与老年患者术后谵妄及认知下降相关，提示生物学易损性在术前已经存在，并可能在外周样本中检测到。在此背景下，循环EVs具有吸引力，因为它们易于从血液中获取，可整合来自多个组织的信号，并可能富集在全血浆或血清中被稀释或不稳定的低丰度分子信息。EV标志物不应被视为CRP、IL?6或TNF?α等传统炎症标志物的简单替代，其潜在优势不在于更早检测或统一的脑特异性，而在于能够通过多重货物内容、相对货物稳定性、部分细胞来源信息以及与PND相关过程的联系（包括炎症、神经血管损伤、胶质细胞活化及突触应激）提供互补的分子信息。

EV用于围术期风险分层的直接证据仍然有限，但已开始形成。在一项接受脊柱手术的老年匹配队列中，Cho等人分析了术前血浆EV microRNAs，在随后发生术后谵妄的患者中鉴定出142种差异表达的miRNAs，其中前10个候选分子（包括miR?548ar?5p和miR?627?5p）在谵妄发作前已升高，并在独立验证集中进行了测试。该研究的重要性在于显示循环EV货物可能反映潜在的围术期易感性，而不仅仅是术后损伤。随后的一项前瞻性研究将这一概念扩展到术前血液样本中的细菌细胞外囊泡（BEVs）。在该队列中，基于显著变化的循环BEV分类群构建的随机森林分类器，其袋外错误率低于基于基线实验室变量或肠道微生物组谱的模型，外部验证准确率达80%；Moraxellaceae及Acinetobacter相关EVs成为最具信息量的分类群。这些研究共同提示，循环EV信号可能在临床恶化显现之前就参与了生物学风险的富集。同时，证据仍较局限，多为单中心研究，且集中于老年脊柱手术人群。目前，循环EVs更适合被视为多模式围术期风险评估的候选辅助指标，而非临床决策的直接替代生物标志物。

4.2 手术与麻醉后细胞外囊泡货物的动态变化

与术前风险标志物相比，术后EV信号是动态的而非固定的。实验研究表明，手术与麻醉可按时间依赖性方式重塑循环EV货物。在小鼠骨科创伤模型中，血清EV内容物在术后6、24及72小时发生变化，miRNA及蛋白质谱的改变与细胞外基质重塑及代谢通路相关。近期在老龄小鼠中的研究显示，麻醉与手术后循环EVs携带独特的蛋白质与miRNAs，并在受体动物中具有生物学活性。在相关老龄大鼠模型中，血浆外泌体miR?182?5p被报道通过抑制BDNF及激活NF?κB促进神经炎症与认知功能障碍，进一步支持术后EV重塑的功能相关性。

人类研究同样提示围术期EV货物随时间变化，但可用证据仍然有限。在接受髋膝关节置换术的患者中，连续血浆与脑脊液采样显示，不良术后神经认知结局与EV货物（包括miRNAs及补体相关蛋白，尤其是EV相关C3）的变化相关，这些发现支持纵向采样的价值，但未能完全解决细胞来源归属问题。在心脏手术中，血浆外泌体多组学分析识别出术后蛋白质与代谢物的改变，包括MMP9、TLR2、ICAM1、S100B的变化，以及术后谵妄患者中与神经炎症及血脑屏障功能障碍相关的通路；这些信号应在包括凝血活化、血液稀释、炎症反应及混合循环囊泡群体在内的复杂围术期背景下进行解读。在老年髋部骨折患者中，围术期血浆外泌体α?突触核蛋白的变化与谵妄严重程度及IL?6变化相关，提示EV相关信号可能反映临床严重程度而非单纯的病例状态，但解读仍受限于囊泡纯度、细胞来源及围术期炎症混杂等问题。综合来看，这些研究提示手术与麻醉可诱导阶段特异性的EV货物重塑，连续围术期采样可能比单次术后测量提供更多信息。

4.3 细胞外囊泡相关信号的诊断与预后潜力

要使EV相关信号在PND中具有临床实用性，它们不仅要反映围术期应激，还应能帮助区分存在相关神经认知损伤的患者，并理想地指示可能的临床轨迹。这是将EVs视为诊断或预后生物标志物而非单纯机制相关物的主要理由。近期关于POD/PND的生物标志物综述强调，具有临床意义的标志物应能从外周生物流体中获取，允许重复采样，并与神经元损伤、神经炎症、内皮功能障碍及血脑屏障破坏等生物学相关过程相对应。EVs在这一方面具有吸引力，因为它们能够浓缩在未分级血浆中难以检测的分子货物，并可能保存来自原本不稳定的信号通路的信息。其潜在价值不依赖于单一分析物，而在于能够同时捕捉多个病理生物学领域。

当前的临床证据支持这一可能性，但仍属探索性。在重大骨科手术、心脏手术及老年髋部骨折患者中的研究提示，围术期EV相关货物可能有助于识别不良神经认知结局、术后谵妄或谵妄严重程度。这些发现支持EV相关信号的潜在诊断与预后价值，因为它们将循环囊泡货物与PND相关的生物学过程联系起来，包括神经炎症、血脑屏障功能障碍、补体相关反应及临床症状负担。然而，这些研究应谨慎解读。EV制备方法在生物流体来源、采样时间、富集策略及下游货物分析上存在差异。总血浆或血清EV制备无法完全解决细胞来源归属问题，且凝血活化、血液稀释、血小板释放、脂蛋白干扰、输血及系统性炎症等围术期因素均可能影响所测EV货物。此外，大多数现有研究规模较小、为单中心设计且具有关联性，尚无EV面板经过验证可用于常规诊断或预后。其他急性脑损伤领域的证据也有助于完善这一生物标志物逻辑。例如，近期创伤性脑损伤研究将富含鞘脂的EVs确定为致病性生物标志物候选者，提示超越总EV计数的、基于货物及亚型的EV生物标志物可能是必要的。目前，EV相关标志物应被视为生物学分层的探索性工具，而非已确立的临床生物标志物。

5 细胞外囊泡信号在PND病理生物学中的作用

5.1 围术期应激与细胞外囊泡重塑

围术期环境为EV释放及货物重塑提供了强烈的生物学背景。组织损伤、缺血?再灌注、内皮活化、凝血及系统性炎症反应均可增加循环EV的生成并重塑其分子组成。在此背景下，关键事件不仅是囊泡数量的增加，而是出现富集炎症、血管、代谢及组织损伤信号的EV群体。在小鼠骨科手术模型中，循环EV蛋白质与miRNAs在术后数小时内即发生改变，并在随后数天内保持动态变化，表明EV重塑是手术损伤反应的早期组成部分。前述人类研究与这一概念一致，显示在骨科、心脏及髋部骨折手术背景下EV货物的围术期变化。

这种早期重塑与PND发病机制相关，因为手术改变的EVs可能为系统性应激信号传递到远端血管、免疫及神经界面提供循环底物。这一可能性在伴有强烈炎症、凝血相关及血流动力学扰动的手术（如重大骨科创伤及体外循环）中尤为合理。然而，EV重塑本身并不能确立直接的脑定向因果关系，而是定义了一个上游围术期事件，可能与可溶性炎症介质、内皮功能障碍及血脑屏障易损性相互作用，从而促进下游中枢神经系统反应。在PND中，围术期应激不仅应被视为可溶性炎症介质的触发因素，也应被视为EV重塑的驱动因素，后者可能促成随后的神经血管及神经炎症改变。

5.2 细胞外囊泡在全身?脑界面的作用

EVs在PND中的致病相关性在于其能够将外周损伤转化为具有神经后果的信号。与游离可溶性细胞因子或损伤相关分子模式（DAMPs）相比，EVs在循环中更稳定，可保护不稳定货物，并能将蛋白质、脂质及核酸递送至远端受体细胞。这使其成为全身?脑通讯的合理介质，尤其是在起始损伤位于颅外而表型表现为脑功能的疾病中。在更广泛的脑?外周信号文献中，EVs日益被视为器官间通讯的载体，而非被动的细胞碎片。同一概念也适用于围术期脑损伤：手术引发的全身反应不仅可通过可溶性炎症介质传递至脑，也可通过囊泡相关分子信号实现。

对这一观点最直接的证据来自转移实验。Gao等人表明，从麻醉与手术后的老龄小鼠中分离的循环EVs足以在受体老龄小鼠中诱导谵妄样行为。这一发现说明术后EVs可携带能够改变脑功能的生物学活性信息。同时，这并不需要所有致病性EVs都穿过完整的血脑屏障并直接进入脑实质的简单模型。更可能的解释是，系统性EVs通过多种途径发挥作用：部分可在允许条件下进入中枢神经系统（CNS）细胞，而其他则可能首先作用于内皮或血管周围细胞，从而引发继发性神经反应。这一解释更符合围术期脑损伤的生物学复杂性。

5.3 细胞外囊泡信号在神经血管功能障碍与神经炎症中的作用

一旦围术期EV信号到达脑部，神经血管单元很可能是首个主要相互作用部位。在PND中，血脑屏障功能障碍日益被视为核心致病事件，而非既定脑损伤的晚期后果。临床发现支持这一观点：术后脑脊液/血浆白蛋白比值升高与老年非心脏手术患者的谵妄及住院时间延长相关，近期一项心脏手术试点研究将术前区域性血脑屏障通透性与后续POD风险联系起来。这些观察将血管?实质界面置于围术期脑易损性的中心位置。

围术期以外的实验研究有助于阐明EVs如何参与这一过程。脑微血管内皮细胞释放参与血脑屏障调节的EV群体，且在炎症条件下其分泌谱及生物学效应会发生改变。在一项补充研究中，脑内皮细胞来源的EVs可穿过血脑屏障，