前脑兴奋性神经元Cc2d1a( coiled-coil and C2 domain containing 1a )条件性敲除通过压后内侧前额叶(prelimbic, PrL)-下丘脑室旁核(paraventricular nucleus of the hypothalamus, PVN)通路降低催产素(oxytocin, OXT)表达从而增加类易激惹行为

《Journal of Biomedical Science》：Conditional deletion of Cc2d1a increases irritability-like behavior by decreasing oxytocin expression via the prelimbic-hypothalamic pathway

　　

摘要：催产素(oxytocin, OXT)系统的失调与多种神经精神疾病特别是孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD)的病理生理相关。研究人员此前利用Cc2d1a( coiled-coil and C2 domain containing 1a )条件性敲除(conditional knockout, cKO)小鼠ASD模型发现恢复OXT水平可有效改善类易激惹行为，但前脑兴奋性神经元中Cc2d1a缺失导致下丘脑室旁核(paraventricular nucleus of the hypothalamus, PVN) OXT表达降低的机制尚不清楚。研究人员采用瓶刷实验(bottle-brush test, BBT)评估野生型(wild-type, WT)及Cc2d1a cKO小鼠的类易激惹行为；应用逆行及顺行跨突触病毒示踪描绘相关神经环路，化学遗传学方法调控神经元活性，光纤记录(fiber photometry)原位监测OXT动态变化，脑片全细胞膜片钳记录PVN OXT神经元突触传递。结果发现成年雄性Cc2d1a cKO小鼠PVN大细胞与小细胞OXT神经元OXT表达均下降，但mRNA水平无相应改变；青春期慢性抑制PVN OXT神经元致成年WT小鼠OXT免疫阳性神经元减少并出现类易激惹行为增高；逆行与顺行跨突触病毒示踪鉴定压后内侧前额叶皮层(prelimbic cortex, PrL)间接调控PVN OXT神经元活性；雄性Cc2d1a cKO小鼠PVN OXT神经元接受兴奋性突触传递选择性降低；后腹内侧杏仁核(posteroventral medial amygdala, MeApv)在体实时检测显示BBT期间Cc2d1a cKO小鼠OXT释放减少；青春期慢性化学遗传抑制PrL-PVN通路可降低成年雄性Cc2d1a cKO小鼠类易激惹行为。该研究表明前脑Cc2d1a缺失在分子及环路水平降低PVN OXT表达，强调OXT系统在作为ASD易激惹管理潜在治疗靶点中的重要角色。

论文解读：

本研究发表于《Journal of Biomedical Science》。孤独症谱系障碍(autism spectrum disorder, ASD)除核心社交沟通障碍及局限兴趣/重复行为外，易激惹(irritability)是常见共患症状，发生率达20–43%，但其神经机制不明。下丘脑催产素(oxytocin, OXT)系统功能异常与ASD社交缺陷相关，且先前研究发现Cc2d1a( coiled-coil and C2 domain containing 1a )前脑条件性敲除(conditional knockout, cKO)小鼠出现PVN OXT免疫反应神经元减少及类易激惹行为，外源性或诱发OXT可挽救该行为，但Cc2d1a缺失如何导致PVN OXT表达降低的机制尚未阐明。为此，研究人员以Emx1-Cre介导前脑兴奋性神经元Cc2d1a缺失的cKO小鼠及野生型(wild-type, WT)同窝对照为对象，综合行为学、病毒示踪、化学遗传学、在体光纤记录及电生理学手段探究其机制。

主要关键技术方法：使用Emx1-Cre;Cc2d1a^f/f(cKO)及Cc2d1a^f/f(WT)小鼠、Oxt-Ires-Cre及R26-LSL-hM4D(Gi)小鼠；瓶刷实验(bottle-brush test, BBT)评估类易激惹行为（攻击性与防御性反应）；逆行示踪剂Fluoro-Gold(FG)标记大细胞OXT神经元区分大细胞与小细胞亚型；逆行(AAV_rg-hSyn-DIO-mCherry注入PVN)与顺行跨突触病毒示踪(AAV₁-hSyn-Cre注入PrL，AAV₅-hSyn-DIO-EGFP注入PVN，Ai14报告小鼠)解析PrL→PVN投射及突触连接类型；化学遗传学(DREADDs, hM4D(Gi))慢性抑制PVN OXT神经元或PrL→PVN通路；在体光纤记录使用GRAB_OT1.0传感器检测后腹内侧杏仁核(posteroventral medial amygdala, MeApv) OXT释放；急性脑片全细胞膜片钳记录PVN OXT神经元微小抑制性/兴奋性突触后电流(mIPSC/mEPSC)；免疫荧光定量OXT及精氨酸加压素(arginine vasopressin, AVP)阳性神经元比例；qPCR检测Oxt mRNA；雌性小鼠行卵巢切除(ovariectomy, OVX)术。

研究结果：

雄性Cc2d1a cKO小鼠PVN OXT表达降低：免疫组化显示12周及24周龄雄性cKO小鼠PVN（非视上核SON）OXT⁺/DAPI⁺比例显著下降，总细胞数无差异；qPCR显示Oxt mRNA水平与WT无差异；FG逆行标记证实大细胞(OXT⁺FG⁺)与小细胞(OXT⁺FG^?) OXT神经元数目均减少，亚型比例不变。结论：Cc2d1a缺失致PVN OXT蛋白表达下降但不影响转录，累及两种OXT神经元亚型。

PVN OXT神经元活动依赖性调节OXT表达：Oxt-Cre::hM4D(Gi)小鼠青春期慢性CNO抑制PVN OXT神经元活性，成年后出现类易激惹行为（攻击反应增加、防御反应减少）及PVN OXT⁺/GFP⁺、OXT⁺/DAPI⁺比例下降，总细胞数不变。光纤记录在体检测MeApv GRAB_OT1.0信号显示BBT期间cKO小鼠OXT释放AUC显著低于WT，且与攻击反应负相关、与防御反应正相关。结论：PVN OXT神经元活动缺失致OXT表达下调并产生易激惹表型；cKO小鼠OXT释放减弱与行为异常相关。

雄性Cc2d1a cKO小鼠PVN OXT神经元兴奋性突触传递减弱：全细胞膜片钳显示cKO与WT间mIPSC频率及幅度无差异，但cKO mEPSC频率与幅度均显著降低。结论：前脑Cc2d1a缺失降低PVN OXT神经元接受谷氨酸能兴奋输入，E/I平衡向抑制偏移致神经元低活性及OXT表达减少。

PrL经GABA能中间神经元间接调控PVN OXT神经元：逆行示踪显示前扣带回(anterior cingulate cortex, ACC)与PrL投射至PVN；顺行跨突触标记示PrL输入经PVN内GAD67⁺GABA能中间神经元间接作用于OXT神经元（转突触标记GFP⁺细胞为GAD67⁺，非OXT⁺）。青春期慢性CNO抑制cKO小鼠PrL hM4D(Gi)神经元使成年BBT攻击与防御异常改善，PVN OXT⁺/DAPI⁺比例回升；电生理示该处理使PVN OXT神经元mEPSC频率恢复（幅度不变），mIPSC无变化。结论：PrL谷氨酸能神经元通过局部GABA能微环路间接抑制PVN OXT神经元兴奋输入；发育期抑制该通路可部分恢复突触传递、OXT表达及行为。

卵巢切除雌Cc2d1a cKO小鼠易激惹行为增加伴PVN AVP而非OXT降低：雌性cKO基础不易激惹，OVX后出现攻击反应升高、防御反应降低；免疫荧光示OVX后PVN OXT⁺比例不变，AVP⁺/DAPI⁺比例显著下降。结论：雌激素具保护作用；雌性cKO OVX后易激惹与PVN AVP而非OXT表达降低相关，提示性别二态性神经肽调控。

讨论与结论：讨论指出本研究发现Cc2d1a cKO雄性小鼠PVN大细胞与小细胞OXT神经元蛋白表达降低但Oxt mRNA不变，提示翻译后或蛋白稳定性调控参与；证实PVN OXT神经元活性依赖OXT表达；鉴定PrL→PVN通路经PVN局部GABA能中间神经元间接调控OXT神经元E/I平衡及OXT表达——Cc2d1a缺失使PrL-PVN投射神经元异常增强局部GABA能抑制或减少谷氨酸微环路对OXT神经元的兴奋驱动，致OXT低表达与易激惹；雌性依赖AVP系统且受卵巢激素调节。局限性包括单一BBT行为学检测、未测PVN AVP神经元E/I平衡、未排除社交减少反馈影响OXT系统等。

结论翻译：本研究揭示了前脑兴奋性神经元Cc2d1a缺失通过压后内侧前额叶皮层(prelimbic cortex, PrL)-下丘脑室旁核(paraventricular nucleus of the hypothalamus, PVN)通路降低PVN催产素(oxytocin, OXT)表达从而增加类易激惹行为的分子与环路机制，明确OXT系统在ASD相关易激惹中的关键作用及其作为潜在治疗靶点的价值。