巴西红蜂胶n-己烷提取物（n-hexane extract from Brazilian Red Propolis, hex-BRP）与两性霉素B（Amphotericin B, AmpB）联用的抗新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）协同作用

《Revista Brasileira de Farmacognosia》：Anti-Cryptococcal Synergistic Activity of the Association Between Amphotericin B and n-hexane Extract from Brazilian Red Propolis

　　

摘要：两性霉素B（Amphotericin B, AmpB）投入使用半个多世纪后，隐球菌病（cryptococcosis）的治疗仍不尽人意。该病由隐球菌属（Cryptococcus）酵母菌引起，死亡率与发病率居高不下，主要归因于现有治疗（通常以AmpB联合伏立康唑等其他抗真菌药）的不良反应及局限性。因此，研究人员通过联用不同类别抗真菌药或天然化合物探索替代疗法。蜂胶（propolis）是蜜蜂采集的植物树脂混合物，其抗菌活性已被广泛研究，其中巴西红蜂胶（Brazilian red propolis, BRP）显示出抗真菌活性，但其抗隐球菌活性尚不清楚。本研究旨在探讨含聚异戊二烯基二苯甲酮（polyprenylated benzophenones）的巴西红蜂胶n-己烷提取物（n-hexane extract of Brazilian red propolis, hex-BRP）对新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）临床菌株的抑制作用，并通过棋盘法（checkerboard method）分析其与AmpB的协同作用。hex-BRP的最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration, MIC）为7.81～1.95 μg/mL。hex-BRP与AmpB对4株新生隐球菌均表现出协同（synergy）或相加（additivity）作用。研究发现hex-BRP可使AmpB的抑制剂量从0.125 μg/mL降至0.031 μg/mL，且该联用效果优于经典氟胞嘧啶（flucytosine）联用方案，提示hex-BRP是重要的潜在治疗策略。

论文解读：巴西红蜂胶n-己烷提取物与两性霉素B抗新生隐球菌的协同作用研究

研究背景与目的

隐球菌病（cryptococcosis）尤以新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）感染多见，好发于免疫功能低下人群，发病率与死亡率较高。目前一线治疗为静脉注射两性霉素B（Amphotericin B, AmpB）联合氟胞嘧啶（flucytosine）或唑类，但AmpB存在明显的肾毒性（nephrotoxicity）及输注相关不良反应，且氟胞嘧啶在部分地区不易获取。蜂胶（propolis）中巴西红蜂胶（Brazilian Red Propolis, BRP）因富含聚异戊二烯基二苯甲酮（polyprenylated benzophenones）而具抗菌潜力，但其抗隐球菌作用及与AmpB联用效应未见报道。为此，研究人员探究巴西红蜂胶n-己烷提取物（hex-BRP）单独及与AmpB联用对C. neoformans的体外抗菌活性与相互作用。

主要技术方法

研究人员选用2株ATCC标准菌株（ATCC 66301、ATCC 28957）及2株临床分离株（H99、B3501）的新生气隐球菌（Cryptococcus neoformans）。按CLSI M27-A3标准 broth微稀释法测定hex-BRP与AmpB各自的最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory Concentration, MIC）；采用棋盘法（checkerboard method）设7个梯度浓度组合（MIC/8至MIC×8，共49组），计算部分抑菌浓度指数（Fractional Inhibitory Concentration Index, FICI）判定协同（FICI≤0.5）、相加（0.5<FICI<1）、无关（1≤FICI<4）或拮抗（FICI≥4）；采用时间杀菌曲线（time-kill assay）于0、6、24 h取样菌落计数（log₁₀CFU/mL），评价单药与联用对真菌生长的动态影响。

研究结果

Results and Discussion

hex-BRP对四株C. neoformans的MIC范围为7.81～62.50 μg/mL（摘要中表述为1.95～7.81 μg/mL为较敏感株结果，文中表2显示有一定株间差异），AmpB各株MIC符合敏感范围。棋盘法结果显示：ATCC 66301株为协同作用（FICI≤0.5），其余三株为相加作用（0.5<FICI<1）；AmpB的MIC在联用条件下降低2～4倍（自0.125降至0.031 μg/mL）。时间杀菌曲线显示联用组菌落计数低于单药组，孵育24 h抑制效应更明显，表现为抑菌（fungistatic）而非杀菌（fungicidal），但联用效果优于AmpB单药。研究人员指出hex-BRP中聚异戊二烯基二苯甲酮可能作用于真菌细胞壁，与作用于细胞膜麦角固醇（ergosterol）的AmpB产生互补机制，但C. neoformans中未直接验证此机制。该联用效果优于或与经典AmpB+氟胞嘧啶方案相当，且可显著降低AmpB用量从而潜在减轻肾毒性。

讨论与结论总结（翻译研究结论部分）

本研究表明富含二苯甲酮（benzophenones）的hex-BRP对新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）具有抑制活性，其机制可能与该类化合物的已知抗真菌特性有关。此外，hex-BRP与一线药物两性霉素B（Amphotericin B, AmpB）联用可降低抑制真菌生长所需之最小抑菌浓度（MIC），与时间杀菌曲线观察到的抑菌活性相符。尽管因菌株数有限应视为初步发现，但该联用代表一种具进一步研究价值之策略，有望增强AmpB抗真菌疗效。后续需进行细胞毒性试验及体内（in vivo）评价加以验证。

发表于《Revista Brasileira de Farmacognosia》（Brazilian Journal of Pharmacognosy / 现Springer刊名为Revista Brasileira de Farmacognosia—Braz J Pharmacogn）。