《Frontiers in Immunology》：BCL-XL drives fibrotic and leukemic progression in myeloproliferative neoplasms
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背景：骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative neoplasms, MPNs）常伴随骨髓纤维化（Bone marrow fibrosis, BMF）和白血病转化，但其维持细胞凋亡抵抗和纤维化进展的细胞及分子机制尚不明确。目的：本研究旨在探讨抗凋亡
背景：骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative neoplasms, MPNs）常伴随骨髓纤维化（Bone marrow fibrosis, BMF）和白血病转化，但其维持细胞凋亡抵抗和纤维化进展的细胞及分子机制尚不明确。目的：本研究旨在探讨抗凋亡蛋白BCL-XL在MPN恶性细胞和基质成分中的生物学及治疗意义。方法：分析来自真性红细胞增多症（Polycythemia vera, PV）、原发性血小板增多症（Essential thrombocythemia, ET）和原发性骨髓纤维化（Primary myelofibrosis, PMF）患者及健康供体的骨髓间充质基质细胞（Bone marrow mesenchymal stromal cells, BM-MSCs）的纤维化表型、凋亡信号及通路激活情况，采用细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8, CCK-8）、免疫荧光、流式细胞术、蛋白质印迹法、羟脯氨酸测定和透射电子显微镜等技术。评估BCL-XL抑制剂ABT-263（navitoclax）单独或与JAK2抑制剂ruxolitinib联合使用的细胞毒性和抗纤维化作用。结果：在JAK2驱动的疾病中，BCL-XL显著上调，并在恶性造血细胞和纤维化基质区室中占主导地位。来自MPN患者的BM-MSCs表现出肌成纤维细胞样表型，特征是α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）和纤维连接蛋白（fibronectin, FN）表达增加。药理学抑制BCL-XL使用ABT-263选择性诱导PMF来源的BM-MSCs发生线粒体凋亡，并减弱其促纤维化特征。机制上，转化生长因子β（transforming growth factor β, TGF-β）在BM-MSCs中激活SMAD3和STAT3信号，表明TGF-β/SMAD3和JAK2/STAT3通路的协同参与。BCL-XL和JAK2的联合抑制在BM-MSCs、MPN后急性髓系白血病（post-MPN acute myeloid leukemia, AML）细胞系及ruxolitinib耐药的患者来源细胞中产生协同抗纤维化和促凋亡作用。结论：综上所述，这些发现确定BCL-XL是MPN相关纤维化和治疗抵抗的关键介导因子，并证实双重靶向BCL-XL和JAK2是治疗晚期MPN的合理策略。
骨髓增殖性肿瘤（Myeloproliferative neoplasms, MPNs）是一类由造血干细胞驱动的慢性克隆性疾病，主要特征为JAK2、CALR或MPL突变导致的JAK–STAT信号级联组成性激活。临床上，患者表现为脾大、全身症状和血栓栓塞并发症，随着疾病进展，部分患者会演变为晚期骨髓纤维化（myelofibrosis, MF）或继发性急性髓系白血病（secondary acute myeloid leukemia, sAML）。尽管JAK1/2抑制剂ruxolitinib是目前治疗的基石，能有效缓解症状并延长生存期，但它无法根除恶性克隆或逆转骨髓纤维化，且在加速期或爆发期MPN中的疗效短暂。鉴于BCL-2家族蛋白通过调节线粒体完整性来调控细胞凋亡，且已知STAT3/5作为突变JAK2信号的主要效应因子可转录诱导BCL-XL，研究人员推测BCL-XL可能在MPN的凋亡抵抗和纤维化进展中发挥关键作用。然而，BCL-XL在骨髓微环境，特别是基质细胞中的表达模式及功能此前 largely undefined。因此，本研究旨在阐明BCL-XL在MPN恶性细胞和基质成分中的作用，并评估其作为治疗靶点的潜力。
为开展这项研究，研究人员使用了多种关键技术与方法。首先，收集了来自不同疾病阶段MPN患者及健康供体的样本，包括骨髓穿刺液、外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）以及骨髓活检组织。通过密度梯度离心分离BM-MSCs和PBMCs，并在体外进行培养扩增。研究中采用了细胞计数试剂盒-8（CCK-8）评估细胞活力，流式细胞术结合Annexin V和7-AAD双染检测细胞凋亡及细胞周期分布。利用蛋白质印迹法（Western blotting）检测BCL-XL、BCL-2、MCL-1、α-SMA、FN、pSTAT3、pSMAD3等关键蛋白的表达水平。免疫荧光显微镜用于观察细胞内蛋白的定位及表达情况，如α-SMA和FN在基质细胞中的表达。此外，还进行了羟脯氨酸测定以评估胶原合成，透射电子显微镜（Transmission electron microscopy, TEM）观察线粒体超微结构变化。在体内实验部分，构建了SET-2细胞表达的 luciferase 报告基因的小鼠异种移植模型（Xenograft model），通过生物发光成像（Bioluminescence imaging, BLI）监测白血病进展，并评估ABT-263的体内疗效。同时，整合了来自Cancer Cell Line Encyclopedia、DepMap以及OHSU和GEO数据库的公共转录组学和CRISPR筛选数据进行生物信息学分析。
研究结果部分首先确认了BCL-XL在MPN进展中的过表达及其与骨髓纤维化的相关性。通过对白血病细胞系及患者样本的分析，研究人员发现BCL-XL在JAK2突变驱动的AML细胞系中表达显著升高，且这些细胞对BCL-XL具有功能依赖性。在患者骨髓样本中，BCL-XL的表达水平与疾病严重程度及纤维化标志物（α-SMA和FN）呈正相关，特别是在PMF患者中最为显著。
其次，研究证实了MPN患者来源的BM-MSCs具有促纤维化表型，且受BCL-XL调控。流式细胞术和形态学分析确认了分离的BM-MSCs的间充质特性。免疫荧光和Western blot分析显示，来自MPN患者的BM-MSCs表现出明显的肌成纤维细胞样分化，其特征是α-SMA和FN表达显著增加。在PMF患者的骨髓基质中，BCL-XL与α-SMA阳性纤维母细胞共定位，而BCL-2和MCL-1表达极低。使用BCL-XL抑制剂ABT-263处理PMF来源的BM-MSCs，可剂量依赖性诱导线粒体途径凋亡，表现为细胞活力下降、Caspase-3活化、细胞色素c释放及细胞周期停滞。同时，ABT-263处理显著降低了α-SMA和FN的表达，显示出抗纤维化效果。
第三，研究揭示了TGF-β/SMAD3和JAK2/STAT3通路在基质纤维化激活中的协同作用。在MPN来源的BM-MSCs中，pSTAT3水平显著升高。体外实验显示，TGF-β1刺激可同时诱导SMAD3和STAT3的磷酸化，且抑制TGF-β受体I（使用Galunisertib）可阻断SMAD3磷酸化并减弱STAT3激活，进而降低FN和α-SMA的表达。这表明炎症和促纤维化信号在STAT3激活处汇聚。
第四，联合抑制JAK2和BCL-XL协同减少TGF-β诱导的纤维化。在健康BM-MSCs中，单独使用JAK2抑制剂ruxolitinib对TGF-β1诱导的纤维化标志物降低作用有限，但联合使用ABT-263和ruxolitinib显著抑制了α-SMA、FN及胶原I的表达，并减少羟脯氨酸含量。在PMF患者来源的BM-MSCs中，联合治疗同样表现出比单药更优的抗纤维化效果。
第五，ABT-263抑制MPN后AML细胞系的细胞活力并诱导凋亡。在体外实验中，ABT-263剂量依赖性地下调HEL和SET-2细胞的活力并诱导凋亡，TEM观察显示线粒体肿胀和嵴断裂。体内实验显示，ABT-263治疗显著抑制了SET-2细胞在小鼠体内的白血病进展，延长了生存期。
最后，靶向BCL-XL克服了ruxolitinib在PMF患者细胞中的耐药性。在对一名ruxolitinib耐药的PMF患者PBMCs的分析中，发现BCL-XL表达显著升高。单独使用ruxolitinib无法有效诱导凋亡，但ABT-263可诱导剂量依赖性凋亡，且联合用药表现出协同促凋亡作用，表明靶向BCL-XL可克服JAK抑制剂耐药。
讨论部分指出，骨髓纤维化和白血病转化是MPN的主要临床难题。本研究确定了BCL-XL作为JAK2突变MPN中恶性造血细胞和纤维化基质成分的关键存活因子。BCL-XL的特异性高表达提示其对JAK2驱动的生存信号具有依赖性。此外，BCL-XL在维持纤维化基质细胞的存活中起核心作用，选择性清除这些细胞可逆转纤维化。TGF-β1诱导的SMAD3和STAT3磷酸化揭示了通路间的串扰，支持了炎症与纤维化信号在STAT3处的汇聚模型。联合靶向BCL-XL和JAK2通过同时阻断上游炎症信号和下游存活机制，产生了协同抗纤维化和促凋亡效应。尽管ABT-263存在血小板减少的风险，但其与ruxolitinib联用的临床前数据支持其作为晚期MPN治疗策略的潜力。研究结论部分总结道，BCL-XL是MPN中凋亡抵抗的关键介导者，连接了恶性细胞存活、基质纤维化激活和治疗抵抗。同时靶向BCL-XL和JAK2能有效破坏纤维化重塑和白血病细胞存活，为旨在改变骨髓微环境并改善晚期MPN预后的双重通路治疗策略提供了依据。
