《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Ex vivo localization of wireless implantable microdevice using high-resolution 3D imaging techniques
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CROSSBRAIN欧盟项目旨在应对脑疾病的异质性特征，开发用于高精度神经调控的无线植入式微机器人（μBot，计划尺寸为100×100×100 μm3）。这类装置能够以极低侵入性精确调节大脑活动，实现对特定时空事件的靶向干预，而这是现有神经调控技术尚无法达到的
CROSSBRAIN欧盟项目旨在应对脑疾病的异质性特征，开发用于高精度神经调控的无线植入式微机器人（μBot，计划尺寸为100×100×100 μm3）。这类装置能够以极低侵入性精确调节大脑活动，实现对特定时空事件的靶向干预，而这是现有神经调控技术尚无法达到的能力。其中，关键步骤在于可视化并确保μBot在脑组织中的最佳植入位置，以便在其植入后评估其功能表现。在本项离体初步研究中，研究人员使用了与实际μBot横向尺寸一致但厚度减小的非功能性硅（Si）模型（100×100×50 μm3），以降低制备和处理难度。由于μBot平台本身存在磁共振（MRI）不兼容性（包括本研究所用的模型及未来开发的功能性设备），且标准组织学方法在处理过程中难以可靠识别和保存植入位点，研究人员开发了一种结合二维和三维技术的综合成像流程。虽然标准组织学方法和组织透明化技术在保存模型于脑组织中的位置方面存在重大局限，但将组织学技术与三维X射线断层扫描相结合提供了一种稳健策略。具体而言，基于同步辐射的X射线相衬断层扫描（XPCT）凭借其固有的高对比度和高分辨率，能够清晰显示模型周围的血管和细胞结构。相比之下，虽然传统显微计算机断层扫描（micro-CT）的应用更为广泛，但其能够为靶向切片提供无损指导。重要的是，本研究作为一篇简短研究报告，展示了CROSSBRAIN项目内一项初步但技术稳健的调查，旨在确定并建立一种优化的成像策略，用于在脑组织中可视化植入的μBot。该方法框架是未来体内研究的初步基础，届时经过验证的成像流程将被用于追踪模型和功能设备，并在生理相关条件下评估随后的异物反应。因此，这一离体工作流程为未来的此类研究提供了必要的技术基础，并明确了本工作作为可行性研究和优化研究的定位。该方法对于新一代与MRI不兼容的植入式技术具有重要价值，能够通过实现精确的设备定位和结构性组织评估，支持未来个性化神经调控疗法的发展。
研究背景与意义
神经退行性疾病和神经精神疾病通常表现为特定神经回路中异质性和动态性的改变，常伴随发作间期及发作期异常电活动。目前的神经调控手段，无论是经颅磁刺激（TMS）、经颅直流电刺激（tDCS）、经颅超声刺激（TUS）等非侵入式技术，还是深部脑刺激（DBS）等侵入式技术，均面临空间选择性差、时间精度不足或侵入性过大等问题。特别是DBS需要植入宏观电极连接皮下脉冲发生器，空间采样有限且刺激几何形状固定，难以靶向深层微小神经元群。此外，植入物引起的异物反应（FBR）涉及急性神经血管损伤、胶质细胞激活和慢性炎症，影响神经元活力、植入物整合及长期功能。CROSSBRAIN欧盟项目旨在通过开发微米级无线自立植入式微器件（μBot，计划尺寸100×100×100 μm3）来解决上述难题。这些微器件旨在以最小侵入性高精度调节大脑区域，并具备毫秒级时间分辨率，有望实现与常规电极相比更稳定的长期脑组织整合及更低的异物反应。然而，由于μBot的材料特性，其存在磁共振（MRI）不兼容性，这给术后可视化确认设备位置及评估周围组织反应带来了巨大挑战。为此，发表在《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》的本研究旨在通过离体实验，开发并评估一套能够精确定位微小植入物并分析周围组织反应的综合成像工作流程。
关键技术方法
研究人员采用成年雄性C57BL/6J小鼠（约30 g）的离体脑组织作为样本队列。首先制备了非功能性硅（Si）模型（尺寸为100×100×50 μm3）模拟真实μBot。随后，将这些模型手动植入固定的小鼠脑组织中。为了全面评估不同成像技术的适用性，研究人员采用了四种主要的影像学及组织学技术路径：一是标准的石蜡包埋苏木精-伊红（H&E）染色光学显微镜检查；二是X-CLARITY组织透明化处理；三是基于实验室的显微计算机断层扫描（micro-CT）；四是基于同步辐射的X射线相衬断层扫描（XPCT）。研究重点考察了各技术在样本制备、设备定位能力、软组织对比度、破坏性/非破坏性以及对下游组织学分析兼容性方面的表现。
研究结果
标准组织学的局限性：器械移位与组织撕裂
单独使用标准组织学方法（石蜡包埋与H&E染色）时，尽管在切片前能在组织中识别出高密度模型，但在染色过程中的反复清洗步骤会导致模型从原始植入部位移位。此外，刚性模型在切片过程中会引起严重的机械破坏，导致组织切片碎裂成多块，完全丧失了植入位点周围组织的空间连续性与形态学完整性。结果显示，在独立组织学分析中，模型的空间对应关系完全丧失（1/1个大脑，100%失败率）。
X-CLARITY的局限性：组织膨胀与微器件移位
针对组织透明化技术（X-CLARITY），研究发现该方法在脂质去除和水凝胶膨胀过程中会导致样本体积显著膨胀（约增加一倍）。这种形态学变化引起了模型的严重移位：在植入的7个模型中，有4个完全未被找回，其余3个虽被找回但均位于远离原始植入点的异位（包括对侧半球或植入孔外数百微米处）。这表明透明化过程引入的宏观变形超出了微观尺度植入物定位所允许的误差范围，不适合用于需要微米级空间精度的植入物-组织界面评估。
XPCT成像实现μBot Si模型的精确定位与组织观察
作为一种先进的三维成像手段，基于同步辐射的X射线相衬断层扫描（XPCT）表现出色。它利用X射线相位移动而非单纯依赖衰减，提供了极高的软组织对比度和微米级分辨率（本研究为3 μm各向同性体素）。研究人员成功地在三维空间中精确定位了所有植入的模型（5/5，100%），且未观察到任何移位。更重要的是，XPCT能够清晰地分辨模型周围的脉管样结构和 putative脑细胞，实现了对植入物与周围微环境空间毗邻关系的无损、高分辨率可视化。
Micro-CT成像用于μBot Si模型的空间定位
鉴于XPCT对同步辐射光源的高门槛，研究人员评估了更易获取的常规显微计算机断层扫描（micro-CT，本研究为20 μm各向同性体素）。虽然micro-CT的软组织对比度不足以分辨细胞细节，但它能够100%准确地在三维体积中定位高密度模型。基于此，研究人员提出了“CT引导下的组织学切片”策略：利用micro-CT确定的植入深度，在接近植入区域时刻意放慢切片速度，精准收集植入点前后的连续切片。结果表明，尽管模型所在位置的切片因刀片撞击而损毁（约损失100 μm厚度），但紧邻植入点前后的组织切片均保持形态完整，从而保留了关键的局部组织反应评估区域。
最终工作流程
综合上述发现，研究人员确立了最终的μBot Si模型定位工作流程：首先对样本进行石蜡包埋，随后进行三维容积成像。若条件允许，优先使用XPCT以获得植入物及其周围软组织的精细三维结构；若条件受限，则使用micro-CT进行精准的空间定位。无论采用哪种三维成像，其生成的空间坐标均可用于指导后续的组织学切片，确保在避开植入物物理损坏区域的同时，获取植入点周边完好无损的组织切片以供分子水平的进一步分析。
讨论与结论总结
在讨论部分，研究人员指出，随着植入式设备的微型化，传统的MRI监测手段因分辨率限制（需达到亚50 μm体素）及设备本身的材料不兼容性而失效。本研究证实，单一模态无法满足所有分析需求：组织学虽能提供卓越的细胞分辨率和特异性染色，但在处理刚性微器件时具有破坏性；组织透明化会引起不可接受的空间畸变；micro-CT易于获取且能准确定位但缺乏软组织对比度；XPCT则是目前唯一能同时实现高对比度三维成像和亚细胞结构细节分辨的技术，尽管其设备准入门槛较高。因此，结合三维成像引导与靶向组织学切片的集成工作流程是解决这一难题的最佳实践。
结论部分强调，植入式设备的微型化趋势虽然有助于减轻异物反应，但也极大地增加了其在脑组织中可视化的难度。本研究提出的离体成像与定位方法，不仅适用于CROSSBRAIN项目的百微米级微器件，也可扩展至其他各类植入式医疗器械的评估。通过将无损三维成像与高精度组织学相结合，研究人员能够有效克服传统方法的局限，为未来在体内慢性实验中评估功能器件的组织整合、生物反应及神经调控疗效奠定坚实的方法学基础。
