《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A patent review of cyclin-dependent kinase 5 (CDK5) inhibitors (1999–2025)
周期蛋白依赖性激酶5（Cyclin-dependent kinase 5, CDK5）是神经元发育和功能的关键调节因子，其过度激活会加剧神经退行性疾病及某些癌症。尽管CDK5是一个具有吸引力的治疗靶点，但由于其与细胞周期依赖性激酶（Cell-cycle CDKs）具有高度的结构同源性，且难以穿透血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB），实现选择性抑制面临巨大挑战。本综述提供了对1999年至2025年间披露的专利化CDK5抑制剂的首次全面分析。研究人员考察了主要化学类型（包括嘌呤类似物如Roscovitine、吡唑衍生物如Dinaciclib和Milciclib、吲哚苯氮卓酮、indirubin衍生物以及新兴的肽类药物）的化学多样性、选择性谱和治疗主张。此外，还讨论了主要障碍，如克服对其他CDKs的脱靶毒性、确保足够的中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）暴露度以及识别可靠的生物标志物。最后，研究人员推测未来的成功将取决于新策略，如p25特异性调节、靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation）和先进的递送系统，以将CDK5的治疗潜力转化为临床应用。
**1. 引言**
周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinases, CDKs）构成了一族高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在调节细胞周期进程、转录、代谢和神经元功能方面发挥关键作用。人类基因组编码了20多种CDKs，传统上按其主要的生理作用分类：细胞周期CDKs（如CDK1, CDK2, CDK4/6）、转录CDKs（如CDK7, CDK8, CDK9）以及非典型CDKs如CDK5。CDK5不由cyclins激活，而是通过与神经元特异性激活因子p35和p39（及其切割形式p25和p29）结合来激活。鉴于其在增殖和疾病中的核心作用，CDKs长期以来一直被作为治疗靶点加以研究，特别是在肿瘤学领域。多种泛CDK抑制剂（如flavopiridol, dinaciclib, seliciclib）已进入临床试验，但其开发受到了剂量限制性毒性和由于亚型选择性差导致的脱靶效应的阻碍。虽然某些CDKs（如CDK4/6抑制剂palbociclib）存在高选择性抑制剂，但由于激酶家族内部的结构相似性以及缺乏真正特异性的小分子抑制剂，CDK5仍然是一个难以攻克的目标。这种药理学空白凸显了开发能够选择性地调节CDK5活性而不干扰其他必需CDK通路的化合物的必要性。CDK5的活性主要局限于神经系统，这是由于CDK5激活因子的神经元特异性表达。早期的体内研究表明，全身性CDK5或p35/p39敲除的小鼠幼崽表现出100%的围产期致死率，并伴有严重的神经元分层缺陷。这些研究清楚地表明，CDK5控制着神经过程中的迁移、神经突生长、树突分枝和轴突伸长等。CDK5还通过磷酸化广泛的细胞骨架蛋白来调节细胞骨架动力学，从而调节神经元形状和突触功能。在神经系统疾病中，CDK5的异常激活并不罕见，并与疾病进展有关。在阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）中，CDK5的过度激活导致tau和淀粉样前体蛋白等病理相关底物的过度磷酸化，导致AD特征的出现并最终导致临床症状。CDK5的高活性还促进神经元细胞周期重新进入，这是AD神经退行性变的一个步骤。在帕金森病（Parkinson’s Disease, PD）中，由多巴胺能毒素（如MPTP或α-突触核蛋白聚集体）触发的CDK5/p25过度激活磷酸化了多种底物，导致黑质纹状体变性。除了神经退行性疾病，CDK5在某些中枢神经系统（CNS）癌症中也过表达并具有功能意义。在胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）患者中，较高的CDK5表达与肿瘤分级和进展相关。CDK5的过度激活通过促进免疫逃逸、细胞骨架重塑和侵袭表型来驱动髓母细胞瘤的转移。
**2. 1999–2025年专利化CDK5抑制剂分析**
针对CDK5靶点的挑战主要源于其与细胞周期CDKs（特别是CDK1和CDK2）的高结构相似性，它与这些激酶共享58%–62%的序列同源性。所有三种激酶均表现出保守的催化结构域，具有相似的ATP结合口袋和底物结合位点，使得选择性抑制剂的设计变得困难。针对CNS疾病的CDK5靶点的一个主要障碍是血脑屏障（BBB），它限制了大多数小分子抑制剂的穿透。现有的CDK5抑制剂通常表现出较差的中枢生物利用度，原因可能是分子量大、极性或受转运蛋白（如P-糖蛋白）的外排作用。虽然某些脑穿透化合物（如TAT偶联肽）在神经退行性变动物模型中显示出BBB穿越和保护作用，但尚无CDK5靶向药物获得临床应用批准。这种局面突显了开发新有效化合物的需求。CDK5抑制剂的选择性因与有丝分裂CDKs共享保守的ATP结合口袋而变得复杂，导致分裂细胞的脱靶细胞周期停滞和细胞毒性。泛CDK抑制剂可能有效抑制驱动神经退行性变的CDK5/p25过度活性，但也会诱导健康分裂细胞的凋亡，从而引发毒性担忧。此外，由于生理性CDK5通过Rb和p21磷酸化维持神经元静息，选择性抑制需要变构或p25特异性调节剂以在阻断过度激活的同时保留这些功能。
**2.1 嘌呤衍生物**
Roscovitine（亦称CYC202/Seliciclib）代表了早期一代CDK抑制剂中基础的三取代嘌呤衍生物。它通过与基于腺嘌呤的化合物olomoucine进行结构活性优化，增强了针对细胞周期调节因子的效力和选择性。Roscovitine在CDK5/p25的ATP结合口袋中竞争性地结合，与铰链区残基（如CDK2的Leu83）形成关键氢键，对CDK1/cyclin B、CDK2/cyclin A/E和CDK5/p25表现出微摩尔级的效力。这种药理特征诱导G1/S和G2/M细胞周期停滞、通过Mcl-1下调诱导凋亡，并通过转录CDKs的脱靶效应抑制RNA聚合酶II CTD磷酸化。尽管在异种移植模型中显示出有希望的抗肿瘤活性并进入II/III期临床试验，但Roscovitine的多药理性、适度的选择性和次优的药代动力学限制了其临床成功，启发了后续吡唑并[1,5-a]嘧啶类似物的开发。早期的专利（如WO1999002162A1）例证了针对增殖障碍的CDK抑制的2,6,9-三取代嘌呤的IP主张，强调了Roscovitine作为选择性CDK调节剂进化中的特权支架的作用。
Purvalanols A和B是第二代嘌呤CDK抑制剂，源自原始的Roscovitine支架，通过从苯基氨基部分去除亚甲基连接体并进行系统的SAR优化，产生了对保守ATP结合裂隙更紧密的参与，并提高了对CDK1/2（在较高浓度下对CDK5）的效力和激酶组选择性。Purvalanol A以低纳摩尔效力抑制Cdc2/CDK1–cyclin B，并在多个肿瘤模型中转化为强大的G1/S和G2/M阻断。尽管在异种移植 settings 中显示出抗肿瘤效力，但其差的 aqueous 溶解度和次优的药代动力学阻止了其超出临床前开发的进展。
**2.2 吡唑衍生物**
Dinaciclib（SCH727965）是一种合成小分子抑制剂，属于吡唑并[1,5-a]嘧啶类杂环。它作为一种强大的ATP竞争性抑制剂，作用于多种周期蛋白依赖性激酶，包括CDK1, CDK2, CDK5, CDK9和CDK12。在结构上，Dinaciclib结合在CDK2的ATP结合口袋中，吡唑氮与Leu83的铰链区主链酰胺形成关键氢键。该化合物显示出强大的CDK介导的磷酸化事件抑制，导致细胞周期在G1/S和G2/M阶段停滞，通过CDK9阻断降低转录延伸，并在各种癌细胞系中诱导凋亡。Dinaciclib在白血病、多发性骨髓瘤和实体瘤的异种移植模型中显示出有希望的临床前效力，并已推进到多个临床试验中。
PHA-793887体现了第三代泛CDK抑制剂中优化的6,6-二甲基-1,4,5,6-四氢吡咯并[3,4-c]吡唑支架。该双环核心在C-6处具有gem-二甲基取代以刚性化吡咯烷环，在C-3处带有3-甲基丁酰胺基以与激酶铰链形成氢键。它 delivering 了亚纳摩尔至低纳摩尔的CDK2/cyclin A, CDK1/cyclin B, CDK5/p25和CDK7的抑制，并在实体瘤系中产生强大的G1/S停滞和凋亡。虽然推进到I/II期试验，但因与新兴亚型选择性药物的重叠概况而停止。
AT7519是一种第二代氨基吡唑为基础的多CDK抑制剂，通过基于片段的药物设计和X射线晶体学发现。核心吡唑-3-羧酰胺支架形成典型的铰链氢键，而氯苯基和哌啶部分占据门控器相邻的疏水区域。它对所有CDK1/cyclin B, CDK2/cyclin A/E, CDK4/6, CDK5, CDK7和CDK9均表现出低纳摩尔效力。AT7519的盐酸盐提高了水溶性以用于静脉注射，尽管因骨髓抑制和次优疗效而终止了临床试验。
Milciclib（PHA-848125）是一种强大的口服生物利用度高的小分子抑制剂，具有1H-吡唑并[4,3-h]喹唑啉支架。作为CDK抑制剂，Milciclib强力抑制CDK2/cyclin A，也影响CDK1, CDK4, CDK5以及TRK A。针对CDK5，Milciclib显示出适度的抑制活性，帮助抑制CDK5介导的磷酸化途径。功能性上，Milciclib诱导细胞周期停滞并促进凋亡，但在精确的CDK5相关治疗作用方面仍需进一步评估。
**2.3 吲哚苯氮卓酮**
Alsterpaullone（亦称9-nitropaullone）是一种典型的paullone类CDK抑制剂，源自kenpaullone的优化。其四环核心允许通过典型的铰链氢键进行竞争性ATP位点结合。该支架对CDK1/cyclin B, CDK2/cyclin A, CDK2/cyclin E和CDK5/p25产生强大的低纳摩尔抑制，同时对GSK-3α/β具有出色的效力。它在神经母细胞瘤、髓母细胞瘤和乳腺癌细胞系中强制执行G1/S和G2/M停滞。然而，由于GSK-3介导的神经毒性和次优的药代动力学，其临床追求受到阻碍。Alsterpaullone的多药理性为后续亚型选择性努力提供了信息，早期的paullone专利涵盖了用于增殖和神经退行性背景的硝基取代吲哚酮。
Kenpaullone是archetypal paullone类CDK/GSK-3双重抑制剂。其四环核心带有9-溴取代基，增强了ATP竞争性结合。该支架对CDK1/cyclin B, CDK2/cyclin A, CDK2/cyclin E和CDK5/p25提供强大的亚微摩尔抑制。虽然CDK5抑制有助于凋亡和干细胞重编程，但机制驱动的神经毒性（来自GSK-3β/CDK5的联合破坏）以及次优的ADME最终阻止了临床开发。
**2.4 indirubin衍生物**
Indirubin-3′-monoxime是天然双吲哚生物碱indirubin的关键衍生物，是一种针对CDKs（特别是CDK1, CDK2, CDK5）以及糖原合成酶激酶-3（GSK-3）的强大ATP竞争性抑制剂。结构上，它在3′位置引入了单肟基团，与indirubin本身相比提高了溶解度和激酶抑制效力。晶体学研究揭示了在ATP口袋中的保守结合模式。功能性上，它诱导细胞周期停滞，抑制Rb和tau蛋白等底物的磷酸化，并在癌症和神经退行性疾病模型中促进凋亡。尽管有希望，但其临床应用受限于次优的药代动力学特性和由于广泛激酶抑制导致的特异性问题。
BIO（6-bromoindirubin-3′-oxime）是一种溴化的indirubin衍生物，在6位置具有溴原子取代。它作为针对CDK1, CDK2, CDK5和GSK-3的强大ATP竞争性抑制剂，在纳摩尔范围内表现出效力。BIO与铰链残基形成关键氢键，其溴取代基促进了激酶活性位点内的疏水接触。功能性上，它诱导强大的CDK1/2/5-和GSK-3β介导的磷酸化事件抑制，导致细胞周期停滞和凋亡。然而，由于次优的选择性和药代动力学挑战，其临床转化受到限制。
**2.5 其他支架**
PHA-767491 HCl是一种双重Cdc7/CDK9抑制剂，具有2-(吡啶-4-基)-1,5,6,7-四氢吡咯并[3,2-c]吡啶-4-one核心。它通过铰链氢键和疏水接触进行ATP竞争性结合。该支架产生强大的Cdc7和CDK9低纳摩尔抑制。功能性上，它阻止DNA复制起始，抑制Mcl-1表达，诱导S期停滞和凋亡。尽管在异种移植中与5-FU显示出协同作用，但因毒性和与亚型选择性药物的重叠概况，临床进展在I期后停滞。
PF-562271（亦称VS-6062）是一种强大、选择性、ATP竞争性和可逆的局灶性粘附激酶（FAK）和相关激酶PYK2抑制剂。化学上，它具有三氟甲基取代的双氨基嘧啶核心。PF-562271在重组酶测定中表现出对CDK5的适度抑制活性（IC50约120 nM），使其成为CDK1, CDK2, CDK3和CDK7等二级靶点簇的一部分。在细胞环境中，PF-562271在1–5 μM浓度下显示出功能性CDK5参与，减弱FAK在Serine 732处的CDK5依赖性磷酸化。这种双重抑制在GBM和胰腺癌模型中抑制细胞迁移和侵袭。神经退行性重定位潜力也在TauP301S神经元模型中得到探索，其中10 μM暴露减少了病理tau在Serine 396/404的磷酸化。然而，所用浓度超过了其在广泛激酶面板中报告的CDK5/p25 IC50，这表明脱靶CDK5抑制可能有助于减少tau磷酸化。
**2.6 肽类**
CDK5抑制肽（CDK5i）包括SEQ ID NO: 2 (ARAFGIPVRCYS)及其细胞穿透衍生物SEQ ID NO: 3。化学上，核心抑制剂包含源自CDK5 p25结合界面的12个氨基酸序列，可选地连接到TAT结构域以促进BBB易位和细胞摄取。CDK5i显示出独特的作用机制，选择性破坏CDK5-p25/p35蛋白质-蛋白质相互作用，而不抑制由p35介导的基础CDK5活性，从而保留对神经发育至关重要的生理激酶功能。这种选择性特征进一步通过在与同源激酶CDK1和CDK2的结合亲和力测试中的缺乏得到强调。在人类家族性AD iPSC衍生的神经祖细胞中，CDK5i处理显著降低了HDAC2和γH2AX的水平。体内效力在P301S AD和额颞叶痴呆小鼠模型中得到证明，腹腔注射导致脑内可检测浓度和脑裂解物中CDK5激酶活性的显著降低，而不影响野生型基础活性。这些特性使CDK5i成为认知功能障碍（包括AD, Huntington’s病和额颞叶痴呆）的高特异性化学探针和候选治疗药物，提供了一种减轻神经退行性变并避免泛CDK抑制相关毒性的策略。
**3. 临床和临床前挑战**
CDK5抑制的障碍包括对其他CDKs的脱靶效应。许多影响CDK5的当前CDK抑制剂也抑制多种其他CDK家族成员，导致多激酶抑制，这可能引起骨髓抑制和器官毒性等不良反应。由于CDK5在神经元功能中发挥关键的生理作用，其广泛抑制会扰乱正常的细胞过程。大多数临床前CDK5抑制剂表现出有限的组织穿透性，特别是跨越BBB到有效水平而不产生全身毒性。在泛CDK抑制剂（如Roscovitine和Dinaciclib）的临床试验中，与脱靶CDK抑制相关的毒性限制了其疗效。开发精确靶向CDK5同时最小化对其他CDKs活性的抑制剂仍然是一个挑战。
另一个挑战是缺乏经过验证的CDK5活性生物标志物。与可以通过直接测量已知底物的磷酸化状态或激酶活性来评估的其他CDKs不同，CDK5的多样化作用，特别是神经元细胞中的作用，以及其由非cyclin激活因子（如p35和p25）的调节，使得直接评估抑制变得复杂。间接标记如CDK5底物的磷酸化水平用于临床前研究以推断靶点参与。例如，CDK5可以磷酸化pAkt在Serine 473和视网膜母细胞瘤蛋白在Serine 780。另一个已知的CDK5底物是FAK，其在Serine 732的磷酸化可用作CDK5活性的可靠标记。此外，CDK5可以在Serine 159自磷酸化，这可用作活性指示剂。然而，这些是情境依赖的，可能受平行途径影响，从而限制特异性。此外，CDK5的活性随着其激活因子和细胞环境的变化而动态变化，使得普遍且稳健的生物标志物不太可能出现。
更新的方法包括开发肽基CDK5抑制剂，旨在更选择性地调节病理CDK5信号传导，并可能促进生物标志物发现。循环CDK5水平或活性相关肽正在作为潜在生物标志物进行研究，特别是在神经退行性疾病中。总体而言，缺乏充分验证的生物标志物阻碍了临床转化，使剂量优化和CDK5抑制剂疗效监测变得复杂。
与占据驱动的抑制互补，靶向蛋白降解（PROTACs）已成为CDK5的一种有希望的模态。通过劫持泛素-蛋白酶体系统，PROTACs实现了CDK5的事件驱动降解，可能绕过活性位点竞争，靶向非催化支架功能，并克服代偿性耐药机制。临床前研究表明，CDK5定向PROTACs在神经退行性和肿瘤学模型中实现了持续的通路抑制，并有早期证据表明其泛CDK抑制剂相比具有改善的亚型选择性。然而，临床转化需要优化血脑屏障渗透性、组织特异性E3连接酶招募和降解特异性药效学生物标志物。
CDK5抑制在动物模型中的测试不能重现人类疾病，主要是由于CDK5调节、脑生理学和病理学的差异。虽然MPTP诱导的帕金森病或CK-p25转基因AD模型有效地证明了CDK5/p25过度激活和抑制剂的神经保护作用，但这些模型未能充分捕获人类tau病进展、淀粉样蛋白β积累动力学和慢性神经炎症。此外，动物模型通常忽视CDK5在成年神经发生和突触可塑性中的生理作用，掩盖了靶点毒性。解释这种差异的主要原因是啮齿动物的加速病理、BBB穿透性模仿人类药代动力学的不发达，以及人类中缺乏的代偿机制，导致效力高估。
将CDK5抑制剂递送到CNS受到BBB的限制，由于紧密的端点连接和外排转运蛋白（如P-gp），BBB限制了>98%的小分子。BBB具有严格的物理化学要求，如低分子量（<400 Da）、log10P = 1–3和最少的氢键供体。许多CDK5抑制剂的特点是差的 aqueous 溶解度、高极性或ABC转运蛋白底物状态，导致低的脑/血浆比率和不足以维持p35/p25抑制的游离脑暴露。新解决方案包括脂质纳米颗粒、BBB穿梭肽（如angiopep-2）或前药策略，尽管取得了进展，但尚无CDK5抑制剂清除临床CNS障碍。
**4. 结论**
CDK5抑制剂的专利格局反映了在神经退行性疾病和癌症中针对该激酶的兴趣不断增长。已披露了一组多样化的化学类型，包括嘌呤类似物、吲哚苯氮卓酮、indirubin衍生物、吡唑衍生物和其他支架。最近的创新包括肽基制剂，如最近披露的CDK5抑制肽，旨在调节认知障碍中的病理CDK5信号。尽管取得了这些进展，但由于ATP位点的高度同源性，实现对其他CDKs（特别是CDK1, CDK2和GSK3β）的真正选择性仍然是一个主要问题，许多专利的小分子抑制剂仍显示出明显多药理性。当前工作重点在于改善神经应用中的脑穿透性，增强激酶选择性，并探索非ATP竞争性机制。结构引导设计和生物标志物驱动开发的持续创新对于将可行的候选药物推进到临床至关重要。
