《Frontiers in Immunology》：Combined Lingzhi Huang capsules and Zeng Jian health tonic accelerates skin wound healing via BMP5-mediated inhibition of ferroptosis
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摘要：引言：灵芝黄胶囊（LZH）和增健保健液（ZJ）是富含多糖和抗氧化成分的中药复方制剂。二者传统上用于增强免疫功能、减轻炎症并促进组织修复。然而，其在皮肤创面愈合中的治疗效果及其潜在机制尚未得到充分阐明。在中医“同病异治”理论指导下，本研究旨在评估LZH和Z
摘要：引言：灵芝黄胶囊（LZH）和增健保健液（ZJ）是富含多糖和抗氧化成分的中药复方制剂。二者传统上用于增强免疫功能、减轻炎症并促进组织修复。然而，其在皮肤创面愈合中的治疗效果及其潜在机制尚未得到充分阐明。在中医“同病异治”理论指导下，本研究旨在评估LZH和ZJ单独应用及联合应用对皮肤创面愈合的影响，并阐明其相关分子机制。
方法：采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对LZH和ZJ的化学成分进行表征。采用小鼠全层皮肤创面模型，通过组织病理学分析、免疫荧光（IF）、蛋白质印迹（Western blot）和蛋白抗体芯片分析评价其治疗作用。在体外实验中，采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）研究血管生成、炎症、氧化应激和铁死亡。整合网络药理学与蛋白芯片谱分析鉴定联合治疗涉及的关键靶点和信号通路，并通过机制实验进一步验证。
结果：LZH和ZJ均可显著加速创面闭合、增强胶原沉积并促进血管生成，其中联合治疗的作用最为显著。在HUVECs中，LZH + ZJ显著增强细胞增殖、迁移和成管能力；提高CD31和VEGF表达；降低活性氧（ROS）水平；升高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）水平；降低丙二醛（MDA）水平，并减轻线粒体损伤。这些效应伴随着谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）和铁蛋白重链1（FTH1）的上调。整合网络药理学与蛋白芯片分析显示，联合治疗显著富集于与血管生成、炎症及铁死亡相关的通路，并鉴定BMP5为核心调控靶点。机制验证表明，BMP5过表达可重现LZH + ZJ的抗铁死亡效应，而BMP5敲低则消除其保护作用。
结论：LZH与ZJ联合给药较任一单药更有效地促进皮肤创面愈合，其机制是通过BMP5介导的信号传导抑制铁死亡、炎症和氧化应激。上述发现为传统治疗理论提供了机制学支持，并提示了一种促进创面愈合的有前景策略。
该论文发表于《Frontiers in Immunology》，围绕灵芝黄胶囊（LZH）与增健保健液（ZJ）在皮肤创面修复中的协同作用展开。皮肤创面愈合是止血、炎症反应、细胞迁移与增殖、细胞外基质沉积及组织重塑等多个阶段高度协调的生物学过程。现有研究表明，若炎症反应失衡、氧化应激过强或血管生成不足，创面将出现再上皮化延迟、胶原沉积受阻以及慢性不愈合等问题。近年来，铁死亡（ferroptosis，一种铁依赖性脂质过氧化驱动的程序性细胞死亡）被认为是影响创面修复的重要病理机制之一，其可通过活性氧（ROS）过量积累、脂质过氧化增强及细胞抗氧化系统崩溃，损害角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞功能，进而抑制组织修复。因此，寻找能够同时调控炎症、氧化应激、血管生成及铁死亡的多靶点干预策略，具有重要理论和临床意义。
研究人员注意到，LZH与ZJ均为富含多糖、三萜、黄酮及抗氧化成分的中药复方，传统上具有增强免疫、减轻炎症和促进组织修复等作用，但二者在皮肤创面愈合中的系统性研究尚不充分。基于LZH偏重免疫调节和抗炎、ZJ偏重抗氧化与维持氧化还原稳态的成分特征，研究人员按照“同病异治”的中医理论，比较了二者单用及联用在创面修复中的效果，并进一步解析其分子机制。研究最终表明，LZH与ZJ均可促进创面愈合，而联合治疗效果最优；其核心机制与BMP5介导的铁死亡抑制、炎症缓解和氧化应激减轻密切相关。这一结果为多成分中药复方促进创面修复提供了机制依据。
本研究主要采用以下关键技术方法：首先通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UFLC-Q-TOF-MS/MS）分析LZH和ZJ化学成分；随后建立雄性C57BL/6小鼠全层皮肤创面模型，设置对照、表皮生长因子（EGF）阳性对照、LZH、ZJ及LZH + ZJ组，结合HE染色、Masson染色、免疫荧光、蛋白质印迹和细胞因子抗体芯片评价体内修复效果。体外采用脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）炎症模型，开展CCK-8、EdU、Transwell、成管实验、流式细胞术、ELISA、透射电镜等检测。并整合网络药理学、蛋白抗体芯片及BMP5过表达/敲低实验进行机制验证。
3.1 LZH和ZJ的化学成分
研究人员采用LC-MS/MS对LZH和ZJ的化学组成进行系统表征。结果显示，LZH中共鉴定出89种化学成分，主要包括黄酮类、羧酸及其衍生物、有机含氧化合物、脂肪酰类和异黄酮类等；ZJ中共鉴定出80种化学成分，主要包括黄酮类、羧酸及其衍生物、有机含氧化合物、脂肪酰类和异戊烯脂类等。该结果说明两种制剂均具有复杂的多成分基础，为其多靶点药理作用提供了化学依据。
3.2 LZH、ZJ及LZH+ZJ对小鼠创面愈合的影响
在小鼠全层皮肤缺损模型中，研究人员通过连续拍照和伤口面积计算发现，LZH、ZJ及联合给药均可促进创面闭合，其中LZH + ZJ组创面缩小最明显，至第14天优于单药组，但EGF组在第14天愈合率仍高于联合组。HE染色显示，各治疗组在第7天即出现创面面积缩小和部分再上皮化，第14天改善更为明显，尤以LZH + ZJ组和EGF组最突出。Masson染色进一步证实，联合治疗显著促进胶原沉积。补充免疫荧光结果显示，α-SMA、CD31和COL-1表达在治疗后增强，提示肌成纤维分化、血管生成和基质重建均得到改善。Western blot和细胞因子检测还表明，TNF-α、IL-6和IL-1α等促炎因子被明显下调，而IL-10升高，说明治疗可优化创面炎症微环境。
3.3 LZH、ZJ及LZH+ZJ促进HUVECs血管生成
为明确其促血管生成作用，研究人员首先通过CCK-8筛选适宜药物浓度，并以100 μg/mL脂多糖（LPS）建立HUVECs炎症模型。EdU实验显示，LZH + ZJ显著增强内皮细胞增殖，且优于单药处理。Transwell迁移实验表明联合组细胞迁移能力明显提高；成管实验进一步证实其可显著增强HUVECs形成管样结构的能力。qRT-PCR、Western blot及免疫荧光结果一致显示，CD31和VEGF表达在联合治疗后显著上调。上述证据表明，LZH + ZJ可直接改善内皮细胞功能并促进血管新生，这是其加快创面修复的重要基础。
3.4 LZH、ZJ及LZH+ZJ的抗炎作用
细胞因子芯片热图显示，三种干预均可降低多种炎症介质水平。进一步的qRT-PCR与Western blot结果显示，LPS刺激可显著上调IL-1α、IL-6和TNF-α，而LZH、ZJ及特别是LZH + ZJ处理均能抑制这些促炎因子的表达。该结果提示，联合给药在抑制炎症级联反应方面具有更强作用，有助于避免持续性炎症对创面修复造成的破坏。
3.5 基于网络药理学的分析
为阐明联合治疗机制，研究人员开展网络药理学分析。Venn分析显示，LZH、ZJ与创面愈合相关靶点存在明显交集，其中LZH相关创面靶点479个，ZJ相关创面靶点411个，二者与创面愈合共有236个共同靶点。PPI网络进一步筛选出联合治疗相关核心靶点。GO和KEGG富集分析显示，LZH主要关联炎症反应、氧化应激和细胞增殖相关过程，显著富集于NF-κB和MAPK等通路；ZJ更偏向免疫调节、刺激应答和细胞抗氧化反应，富集于细胞因子、VEGF和Toll样受体相关通路。相比之下，LZH + ZJ组呈现更广泛的富集谱，显著涉及血管生成、氧化应激、炎症反应以及PI3K-Akt、VEGF、MAPK、NF-κB和铁死亡等信号通路。该部分结果提示，联合治疗的优势可能源于其对多个关键病理环节的综合调控。
3.6 LZH、ZJ及LZH+ZJ在体外抑制铁死亡
基于网络药理学提示，研究人员进一步检验铁死亡相关指标。流式细胞术结果显示，与单药及模型组相比，LZH + ZJ组细胞内ROS水平显著下降。ELISA检测发现，联合处理可提高超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）水平，并降低丙二醛（MDA）水平，提示抗氧化防御增强、脂质过氧化减轻。Western blot和免疫荧光进一步表明，铁死亡抑制相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）和铁蛋白重链1（FTH1）在联合组显著上调。透射电镜观察到联合治疗后线粒体超微结构保存更完整。该组结果从生化、分子和超微结构多个层面支持LZH + ZJ能够有效抑制铁死亡。
3.7 LZH和ZJ联合通过激活BMP5抑制铁死亡
蛋白抗体芯片分析显示，联合治疗后多种差异蛋白发生变化，其中BMP5上调最为显著之一。RT-PCR证实BMP5表达显著升高。为探讨其功能，研究人员通过Co-IP发现BMP5可能与GPX4存在相互作用，而与SLC7A11或FTH1未检测到明确相互作用。随后构建BMP5过表达HUVECs模型，结果显示BMP5过表达可降低ROS积累，提高SOD和GSH水平、降低MDA水平，并上调GPX4、SLC7A11和FTH1表达，表现出与LZH + ZJ相似的抗铁死亡效应。进一步救援实验显示，尽管LZH + ZJ可增强细胞活力、降低ROS并提高上述铁死亡相关蛋白表达，但在BMP5敲低后，这些保护效应被明显逆转。由此可见，BMP5是联合治疗发挥抗铁死亡作用的关键功能分子。
讨论部分指出，创面愈合障碍与持续炎症、氧化应激失衡、血管生成受损及细胞死亡异常密切相关。本研究通过体内外实验、网络药理学和机制验证，系统说明LZH与ZJ无论单用还是联用，均可改善创面修复，而联用效果最强。论文特别强调，LZH可能更偏向抑制炎症通路，ZJ更偏向增强抗氧化能力，二者联用后对炎症、氧化应激、血管生成及铁死亡形成更为整合的调控网络。研究还指出，细胞因子调控模式存在差异，例如ZJ单药诱导IL-10升高更明显，而联合治疗呈现更均衡的免疫调节特征，这与网络药理学分析结果相吻合。关于铁死亡，论文认为其不仅见于糖尿病创面，也可在非糖尿病条件下由局部炎症和氧化应激失衡驱动。本研究中联合治疗通过提高GPX4、SLC7A11和FTH1表达，维持氧化还原稳态并保护线粒体结构，从而减轻铁死亡损伤。BMP5则被确立为这一过程的重要调节节点。作者同时指出局限性，包括体外实验仅使用HUVECs、尚缺乏人源样本验证、BMP5在体内的因果作用仍需进一步实验确认，以及尚未引入转录组学以全面刻画调控网络。
研究结论部分可译为：总之，本研究表明，灵芝黄胶囊和增健保健液无论单独还是联合应用，均可通过增强血管生成、抑制炎症反应和缓解氧化应激而显著促进皮肤创面愈合。尤为重要的是，联合治疗显示出更优疗效，并被证实可通过激活BMP5抑制铁死亡，从而揭示了一条将传统草药治疗与创面修复中氧化还原依赖性细胞死亡相联系的先前未被认识的调控通路。通过整合化学成分分析、功能实验、网络药理学和机制验证，本研究为理解复杂草药复方的多靶点治疗作用提供了系统框架。这些发现不仅为LZH和ZJ的传统应用提供了机制学支持，也提示BMP5介导的铁死亡抑制可能成为改善创面愈合结局的有前景策略。
