《Digital Discovery》：Spectroscopy-assisted Bayesian optimization for efficient refolding of inclusion body proteins
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大肠杆菌中重组蛋白的生产常产生不溶性的包涵体，这些包涵体需要变性剂溶解和复折才能获得天然活性产物。蛋白质复折步骤通常构成主要瓶颈。传统的开发和优化通常依赖带有高效液相色谱（HPLC）读数的实验顺序设计（DoE）。这种方法缓慢、劳动密集型，且需要建立色谱方法以及
大肠杆菌中重组蛋白的生产常产生不溶性的包涵体，这些包涵体需要变性剂溶解和复折才能获得天然活性产物。蛋白质复折步骤通常构成主要瓶颈。传统的开发和优化通常依赖带有高效液相色谱（HPLC）读数的实验顺序设计（DoE）。这种方法缓慢、劳动密集型，且需要建立色谱方法以及纯化的蛋白标准品。在工艺开发的早期阶段，这些先决条件可能无法满足——特别是对于只能以包涵体形式表达的蛋白。研究人员引入了一种更高效、数据驱动的工作流程，将贝叶斯优化（BO）与源自内源色氨酸（Trp）荧光的快速在线读数相结合。通过使用二硫键连接的单链可变片段（scFvM），研究人员探索了复折缓冲液组成的五维设计空间（二硫苏糖醇（DTT）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）、稀释倍数、pH值和最终尿素浓度），并受两个光谱衍生目标引导。研究结果表明，光谱位移与色谱产率相关，支持其作为适合目的的传感器，指导仅用25次实验的工艺开发。贝叶斯优化确定了能实现1.29 ± 0.06 g L?1复折蛋白浓度、58.7 ± 1.3%复折产率且稀释倍数为3.14的条件，而采用超过60次实验的三阶段DoE方案得出的结果为0.37 ± 0.02 g L?1和61.4 ± 3.1%，稀释倍数为11.39。因此，所示工作流在可比产率下实现了约3.5倍更高的产物浓度，同时在显著更高的蛋白浓度下运行。因此，光谱辅助贝叶斯优化被发现是一种实用的、节省样品的高效复折优化工具，在开发早期阶段尤其有价值。
在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达重组蛋白时，常形成不溶性的包涵体（Inclusion bodies, IBs）。尽管过去被视为缺陷，但如今认为包涵体表达策略通过提高时空产率、简化初步回收并保护产物免受蛋白酶解，具有吸引力。然而，包涵体的形成需要高效的溶解和复折步骤以获得功能性蛋白，这一步骤往往是下游加工的主要瓶颈，尤其是对于含二硫键或辅因子的蛋白。由于蛋白质折叠与聚集之间的平衡受变性剂稀释、氧化还原环境、pH值、蛋白浓度和化学添加剂等多维因素的复杂非线性影响，且早期开发阶段材料稀缺、缺乏适合目的的分析参考标准，使得复折工艺的开发和优化极具挑战性。传统的工艺开发依赖实验设计（Design of Experiments, DoE）结合离线或在线高效液相色谱（HPLC）进行蛋白定量。虽然DoE优于单因素实验，但其面临实验强度高、低阶多项式模型僵难以捕捉特定蛋白响应景观、HPLC耗时费力且需消耗纯化标准品等局限性。因此，实施过程分析技术（Process Analytical Technology, PAT）在复折中仍是例外。内源色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）荧光作为一种无标签光谱PAT工具，能反映蛋白从变性态向天然态转变过程中局部化学环境的变化。基于此，研究人员提出了一种结合内源Trp荧光与贝叶斯优化（Bayesian optimization, BO）的新型复折工艺开发方法，旨在解决早期开发中标准品缺乏及优化效率低的问题。
研究人员利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株产生的包涵体形式的单链可变片段（scFvM）作为模型蛋白，开展了对比研究。研究对比了传统的顺序DoE/HPLC方法与光谱辅助BO方法的效率及效果。DOE方法在五个维度的参数空间（溶解阶段的DTT浓度、复折缓冲液的pH值、稀释因子、GSSG浓度及最终混合物中的尿素浓度）中进行了三阶段共68次实验。BO方法则利用内源Trp荧光衍生的两个目标——光谱位移（$\Delta$AEW）作为复折产率的代理响应，以及体积滴度代理（$P_{proxy}$），在相同的五维空间中进行了25次实验。
在研究结果方面，传统DoE部分显示，初始筛选DoE（DoE1）对复折scFvM浓度的预测力较低（$Q^2$=0.60），验证实验结果远低于预测值。经过两轮缩减参数范围的优化DOE（DoE2和DoE3），虽然模型拟合度提高，但仅确定了部分关键参数（pH和尿素浓度），且由于操作者的主观决策，排除了GSSG。最终DoE优化得出的最佳条件为复折浓度0.37 ± 0.02 g L?1，产率61.4 ± 3.1%，稀释因子高达11.39。光谱代理验证部分表明，内源Trp荧光强度加权平均发射波长（AEW）的变化能反映scFvM的构象状态，且终点光谱位移（$\Delta$AEW）与HPLC测得的复折产率呈显著线性相关（$R^2$=0.71），证明其可作为无需纯化标准的代理指标。BO优化部分显示，通过q-噪声期望超体积改进（qNEHVI）采集函数，算法在25次实验内收敛至帕累托前沿。BO识别出的最佳条件为：pH 10.7，尿素3.64 M，稀释因子3.14，GSSG 2.5 mM，DTT 6.13 mM。该条件实现了1.29 ± 0.06 g L?1的复折浓度，产率为58.7 ± 1.3%。
讨论部分指出，DOE与BO的主要差异在于稀释因子的优化结果。稀释因子以几何级数影响蛋白浓度，导致数据存在异方差性，且DOE在处理冲突目标（高产率vs高浓度）时依赖标量化，容易陷入局部最优或因过早排除变量（如GSSG）而遗漏关键信息。BO通过概率代理模型灵活处理非线性及交互作用，避免了手动缩减设计空间，不仅发现了GSSG在低稀释因子下的积极作用，还在约三分之一的实验次数下实现了约3.5倍的更高产物浓度。研究结论部分总结道，光谱辅助贝叶斯优化为蛋白复折工艺开发提供了一种比顺序DoE/HPLC更实用、更节省样品且高效的替代方案。该方法在无需纯化蛋白标准或完全验证色谱方法的情况下，通过整合内源Trp荧光与多目标BO，快速定位了高性能操作窗口，显著降低了水和尿素消耗，并为整合高通量系统及闭环实验奠定了基础。
