SARS-CoV-2 Nsp13解旋酶解析G-四链体并被G4配体或抗病毒调节因子抑制：对G4抗冠状病毒治疗的启示

《Journal of Biological Chemistry》：SARS-CoV-2 Nsp13 Helicase Resolves G-Quadruplexes and is Inhibited by G4 Ligands or an Anti-Viral Regulator: Implications for G4 Anti-Coronavirus Therapies

　　

COVID-19大流行常被视为百年一遇的事件。然而，新变异株的出现以及相关冠状病毒感染的潜在风险仍然是重大关切。疫苗成功地遏制了COVID-19，但用于治疗COVID-19或长新冠（Long COVID）患者的抗冠状病毒药物尚不强劲。研究人员确定，SARS-CoV-2 Nsp13解旋酶以ATP刺激的方式解析各种拓扑结构的G-四链体（G-quadruplex, G4）。此外，对DNA-G4侧翼5?-单链尾的需求表明其5?→3?易位方向性。研究人员测试了G4配体对Nsp13 G4解旋酶活性的抑制。PhenDC3抑制Nsp13解析四链平行G4（半数抑制浓度IC₅₀ = 0.06 nM），其效力比解析双链反平行G4（IC₅₀ = 9 nM）强150倍，比主要的人类G4解旋酶FANCJ解析四链平行底物（IC₅₀ = 41 nM）强680倍。Nsp13还能够解析单分子RNA-G4底物，包括一个源自SARS-CoV-2的RNA-G4形成序列，该过程由其内在ATP酶活性强烈刺激。Nsp13催化的RNA-G4底物解析被G4配体PhenDC3以剂量依赖方式抑制。与Nsp13解析RNA G-四链体的生化研究一致，用几种G4配体处理的Nsp13转染人类细胞显示RNA-G4积累减少。抗病毒调节因子细胞核酸结合蛋白（Cellular Nucleic Acid Binding Protein, CNBP）与Nsp13相互作用并在体外抑制Nsp13 G4解旋酶活性，提示一种宿主机制来调节Nsp13依赖的SARS-CoV-2复制，这可能对基于G4的冠状病毒治疗具有启示意义。

**研究背景、问题与目的**
COVID-19大流行由SARS-CoV-2引起，尽管疫苗接种取得成功，但针对COVID-19和长新冠的治疗药物仍不充分。SARS-CoV-2基因组包含约30 kb的正链单链RNA，编码非结构蛋白Nsp13（唯一的解旋酶）。G-四链体（G4）是由富含鸟嘌呤序列形成的非经典核酸二级结构，在病毒和宿主基因组中发挥调控作用，被视为抗病毒药物的潜在靶点。然而，此前尚无证据表明SARS-CoV-2编码的蛋白能够解析G4。本研究的目的是：1）确定Nsp13是否具有G4解旋酶活性；2）表征其作用机制；3）评估G4稳定配体及宿主抗病毒调节因子CNBP对Nsp13 G4解旋酶活性的抑制效果。该研究发表在《Journal of Biological Chemistry》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用杆状病毒系统表达并纯化重组Nsp13野生型（WT）及其ATP酶失活突变体Nsp13-K288R。利用放射性标记的DNA-G4底物（四链平行TP-G4和双链反平行CGG-G4）进行多轮G4解析实验，通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳和磷屏成像分析产物。采用荧光标记的单分子RNA-G4底物（源自VEGFA或SARS-CoV-2序列P4）进行实时动力学检测。通过电泳迁移率变动分析（EMSA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）研究蛋白-核酸及蛋白-蛋白相互作用。在细胞实验中，将Nsp13质粒转染至HeLa（宫颈腺癌）、U2OS（骨肉瘤）和A549（肺泡基底上皮腺癌）细胞系，用G4配体处理，使用RNA G4特异性染料QUMA-1进行免疫荧光分析。

**研究结果**
**Nsp13以ATP依赖和蛋白浓度依赖的方式解析四链平行G4结构**：重组Nsp13-WT在ATP存在下解析TP-G4底物，而ATPγS、AMP-PNP或无核苷酸条件下无活性；ATP酶失活突变体Nsp13-K288R完全失去活性；动力学分析表明初始速率为26 pM G4/nM Nsp13/min。

**Nsp13解析双链反平行G4结构需要5?-单链尾并依赖其内在ATP水解**：Nsp13解析5?-尾化的CGG-G4底物，但对3?-尾化底物无活性；同样依赖ATP；K+稳定下的G4解析效率低于Na+。

**G4配体抑制Nsp13的G4解析活性**：五种G4配体（PDS、PhenDC3、BRACO19、TMS、TMPyP4）以浓度依赖方式抑制Nsp13对TP-G4的解析，IC₅₀分别为13.7 nM、0.06 nM、33 nM、3 nM和18 nM；对叉状双链DNA解旋活性无抑制。PhenDC3对TP-G4的抑制效力比CGG-G4强约150倍，比人类FANCJ解旋酶强约680倍；热稳定性实验表明PhenDC3对TP-G4的稳定作用强于CGG-G4。

**CNBP特异性抑制Nsp13的G4解析活性**：CNBP以浓度依赖方式抑制Nsp13对TP-G4的解析，但不抑制叉状双链解旋；对FANCJ G4解旋酶活性无抑制；CNBP直接与Nsp13和FANCJ结合，但亲和力不同（K_d分别为811 nM和113 nM）；CNBP本身能非酶促解折叠CGG-G4底物。

**Nsp13解析单分子RNA-G4底物**：Nsp13-WT以ATP依赖动力学方式解析rG4-A15-VEGFA底物，Nsp13-K288R活性极低；PhenDC3以剂量依赖方式抑制该活性；5?-ssRNA尾长增加（0-25 nt）增强解析速率；Nsp13也能解析SARS-CoV-2来源的RNA-G4（SARSP4-A15）。

**Nsp13表达减少人类细胞中G4的积累**：在HeLa、U2OS和A549细胞中，Nsp13-WT转染并PDS处理后，QUMA-1染色显示的RNA-G4水平显著低于空载体对照；Nsp13-K288R部分降低G4积累；TMS和PhenDC3处理也观察到类似效果。

**讨论与结论**
本研究确定Nsp13是一种真正的G4解旋酶，能解析多种拓扑结构的DNA-G4和RNA-G4底物，其活性依赖5?-单链尾和ATP水解。Nsp13的G4解旋酶活性被G4稳定配体PhenDC3高效抑制，尤其是对四链平行G4，且抑制效力远强于人类主要G4解旋酶FANCJ。宿主抗病毒因子CNBP特异性抑制Nsp13的G4解析活性，但不影响FANCJ，提示CNBP可能通过限制Nsp13依赖的G4解析来拮抗SARS-CoV-2复制。细胞实验进一步证实Nsp13减少RNA-G4积累，且该作用部分依赖其ATP酶活性。研究结论：Nsp13的G4解旋酶活性为基于G4的抗冠状病毒治疗提供了新靶点，G4配体（如PhenDC3）和宿主因子CNBP均可作为调节该活性的潜在工具，开发新型抗病毒策略需要进一步比较Nsp13与宿主G4解旋酶对G4配体的敏感性。