新型三重电荷整体柱的制备与评价用于亲水作用色谱

《Journal of Chromatography Open》：Fabrication and evaluation of a novel triple-charged monolith for hydrophilic interaction chromatography

　　

在本研究中，研究人员通过热引发自由基聚合，在由水和正丙醇组成的混合致孔剂体系中，以VBDSB（3-(4-(4-乙烯基苄基)-1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-1,4-二鎓-1-基)丙烷-1-磺酸盐）为功能单体，N,N′-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，制备了一种用于亲水作用色谱（HILIC）的新型整体柱。在优化聚合参数后，所得到的HILIC整体柱在纳米液相色谱（nano-LC）系统中进行评估，表现出令人满意的柱效（0.25 mm/s时68,295 N/m）和良好的渗透性（在100%水、100%乙腈（ACN）和100%甲醇（MeOH）中，K值保持在同一数量级）。此外，在流动相中乙腈比例从5%到95%（v/v）的宽范围内，观察到该整体柱具有典型的HILIC保留行为特征。这种行为可归因于磺基甜菜碱和季铵基团的引入，增强了整体柱的亲水性。制备的色谱柱实现了对一系列极性化合物（包括苯甲酸类、核碱基、酚类以及尿素/尿囊素）的高分辨率、选择性和高效分离。总之，这种三重电荷组合提高了整体材料的亲水性，同时增强了固定相对带电分析物的离子吸引力。因此，预期有更高的保留，但可能导致峰质量下降。

## 论文解读：新型三重电荷整体柱在亲水作用色谱中的制备与性能评价

### 研究背景与意义

亲水作用色谱（HILIC）是分离极性化合物的关键技术，广泛应用于药物发现、临床诊断、环境监测和食品安全等领域。然而，传统反相液相色谱（RPLC）对极性物质保留不足，推动了对HILIC固定相的研究。现有HILIC固定相多基于硅胶表面化学修饰，但硅胶基质在pH>8时易发生溶解，导致柱效下降和寿命缩短。因此，开发具有良好pH耐受性的新型HILIC材料成为研究热点。有机聚合物整体柱因制备快速、渗透性高、pH耐受性好且易于功能化，展现出显著优势。近年来，多种两性离子（zwitterionic）HILIC整体柱被开发，如磺基甜菜碱（sulfobetaine）和羧基甜菜碱（carboxybetaine）型，但进一步提高亲水性仍具挑战。本研究引入了一种三重电荷单体VBDSB（3-(4-(4-乙烯基苄基)-1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷-1,4-二鎓-1-基)丙烷-1-磺酸盐），其同时含有磺基甜菜碱基团和额外的季铵基团，旨在增强整体柱的亲水性和静电相互作用，从而提升极性化合物的分离性能。该工作发表在《Journal of Chromatography Open》上。

### 主要技术方法

研究人员采用热引发自由基聚合法，以VBDSB为功能单体、N,N′-亚甲基双丙烯酰胺（MBA）为交联剂、2,2′-偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，在水/正丙醇二元致孔体系中，于γ-MAPS功能化的熔融石英毛细管（100 μm I.D.×375 μm O.D.）内原位合成聚(VBDSB-co-MBA)整体柱。通过扫描电子显微镜（SEM）、能量色散光谱（EDS）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）表征形态和化学组成；利用Zeta电位分析和Van Deemter图评估表面电荷和柱效；通过改变流动相中乙腈（ACN）比例（5%-95%）考察保留机制；最后，以苯甲酸类、核碱基、酚类化合物及尿素/尿囊素为模型分析物，在自组装纳米高效液相色谱（nano-HPLC）系统中评价分离性能。所有标准品均为商业来源，未涉及特定样本队列。

### 研究结果

#### 3.1 聚(VBDSB-co-MBA)整体柱的制备

通过系统优化单体/致孔剂比例、交联剂/单体比等参数，确定了最佳聚合配方（亲水整体柱C3：MBA:VBDSB=30:70，H₂O:n-propanol=10:90，单体:致孔剂=35:65）。该柱在500 nL/min流速下对甲苯、尿嘧啶和硫脲的分离展现出61,650 N/m的柱效和0.6 MPa的背压，综合性能最优。

#### 3.2 聚(VBDSB-co-MBA)整体柱的表征

- **形貌与元素分布**：SEM显示整体柱内表面均匀覆盖花椰菜状聚集体，具有大量相互连通的孔隙；EDS检测到碳、氮、氧、硫元素，其中硫的存在证实VBDSB成功共聚进入固定相。
- **表面电荷性质**：Zeta电位测量表明，在pH 2.0-9.0范围内，整体柱表面呈正电位（由于VBDSB单体带+1净电荷）；pH升至10.0时，Zeta电位转为负值，归因于氢氧根离子吸附。
- **柱效与渗透性**：Van Deemter曲线显示最低理论塔板高度（H）为14.64 μm，对应最大柱效68,295 N/m（线性流速0.25 mm/s）。在不同流动相（ACN、MeOH、H₂O）中，背压与线性流速呈线性关系（R²>0.99），且渗透率K值保持同一数量级，表明整体柱结构完整、机械稳定性好。
- **保留机制**：随着流动相中ACN比例从5%增至95%，甲苯保留因子几乎不变，而尿嘧啶和硫脲保留因子持续增大，符合典型HILIC保留行为。未观察到向RPLC模式转变的“转折点”，说明额外季铵基团增强了水化层厚度，使亲水作用始终主导分离。

#### 3.3 极性小分子的分离

- **苯甲酸类化合物分离**：在ACN/10 mM甲酸铵（90/10, v/v, pH 3）条件下，苯甲酸（BA）、4-羟基苯甲酸（4-HBA）、3-羟基苯甲酸（3-HBA）和2,6-二羟基苯甲酸（2,6-DHBA）实现基线分离。中性分析物按log P值顺序洗脱；离子化的2,6-DHBA因静电吸引和亲水作用协同而保留最强，但出现前伸峰，可能是离子交换位点局部过载所致。
- **核碱基分离**：在pH 10条件下（所有分析物为分子态），胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和尿苷的洗脱顺序与log P值基本一致，但腺嘌呤因具有更多氢键受体而保留更强。
- **酚类化合物分离**：苯酚、对苯二酚、焦性没食子酸和间苯三酚的分离中，静电作用可忽略，保留顺序主要受log P值和氢键能力影响。焦性没食子酸比对苯二酚保留更强，因其氢键供体和受体数量更多。
- **尿素/尿囊素分离**：在H₂O/ACN（25/75, v/v）条件下，6分钟内实现尿素与尿囊素的高效分离（分辨率R=10.26），进一步证实了整体柱对极性化合物的优异选择性。

### 总结与讨论

本研究成功制备了聚(VBDSB-co-MBA)亲水整体柱。系统优化和表征表明，该柱具有令人满意的渗透性、良好柱效（68,295 N/m）以及在5%至95%乙腈范围内典型的亲水保留机制。三重电荷组合（磺基甜菜碱+季铵基团）显著增强了固定相的亲水性和离子吸引力，实现了对苯甲酸类、核碱基、酚类及尿素/尿囊素等极性化合物的高效分离。这项工作为增强HILIC整体柱亲水性提供了新策略，丰富了HILIC固定相多样性，并为两性离子与阳离子基团在HILIC应用中的整合提供了有价值的参考。然而，当前研究缺乏与现有磺基甜菜碱整体柱的直接比较，以及对盐浓度、pH和离子强度的系统评估，需进一步探究以阐明保留机制并提升性能。

**研究结论翻译**：在本研究中，研究人员通过原位热引发聚合制备了一种用于纳米液相色谱（nano-LC）应用的新型聚(VBDSB-co-MBA)亲水整体柱。经过系统优化和表征，所得整体柱表现出令人满意的渗透性、良好的柱效以及在5%至95%乙腈（ACN）含量范围内的典型亲水保留机制。此外，成功分离了一系列极性化合物，包括苯甲酸类、核碱基、酚类和尿素/尿囊素。总的来说，这项工作不仅为增强HILIC整体柱亲水性提供了新策略并丰富了HILIC固定相的多样性，而且为两性离子与阳离子基团在HILIC应用中的整合提供了有价值的参考。尽管如此，本研究缺乏与现有磺基甜菜碱整体柱的直接比较以及对盐浓度、pH和离子强度的系统评估。需要进一步研究这些方面以阐明保留机制并提升性能。