设计能够响应ROS（ROS是ROS（Robot Operating System）的缩写）信号的大小可变纳米组装体，以重新编程动脉粥样硬化斑块的微环境并激活自噬机制，从而用于动脉粥样硬化的治疗

《Journal of Controlled Release》：Engineering ROS-responsive size-transformable nanoassemblies to reprogram plaque microenvironment and activate autophagy for atherosclerosis therapy

　　

王彦彦|齐凯顺|李悠悠|魏瑞瑞|娄远达|刘敏|魏胜江|赵雅洁|刘建平|何洪亮|张文丽

中国河南大学第一附属医院抗体药物工程联合国家实验室，河南省开封市475000

摘要

氧化应激和巨噬细胞自噬功能障碍共同导致斑块脆弱性和破裂，最终引发急性动脉血栓性心血管事件。然而，目前仅基于抗氧化干预或自噬诱导的单一疗法仍不足以有效管理动脉粥样硬化。本文报道了一种具有内在活性氧（ROS）清除能力的阳离子抗氧化剂右旋糖酐衍生物（DKT）的开发，该衍生物旨在与载有雷帕霉素的重构高密度脂蛋白（RC-rHDL）共同使用，以实现协同治疗动脉粥样硬化的效果。通过静电相互作用，DKT使小分子的RC-rHDL组装成大分子的纳米组装体（RT-rHDL），从而实现高效的血管靶向和斑块内的ROS触发解体。体外研究表明，RT-rHDL纳米组装体通过结合ROS清除和自噬激活，有效抑制了泡沫细胞的形成，减轻了炎症并减少了细胞凋亡。体内实验显示，RT-rHDL纳米组装体通过内皮细胞结合在动脉粥样硬化病变处积聚，并深入富含泡沫细胞的斑块中。在apoE^?/?小鼠中进行的三个月静脉治疗显著减少了斑块大小，最小化了坏死核心区域，缓解了局部炎症，并增强了斑块稳定性。机制研究证实，全身和病变部位的氧化应激减轻以及巨噬细胞自噬的恢复是这些治疗效果的基础。总体而言，我们的发现强调了同时调节细胞功能和斑块微环境的重要性，为动脉粥样硬化治疗提供了一种新的协同纳米治疗策略。

引言

动脉粥样硬化（AS）是一种多灶性和多因素引起的慢性炎症性疾病，是急性动脉血栓性心血管事件的主要病理生理因素[1]，[2]。该疾病始于血管内皮损伤，这促进了单核细胞的募集和低密度脂蛋白（LDL）向内膜下空间的浸润。单核细胞随后分化为巨噬细胞，这些巨噬细胞过度吞噬LDL衍生物——尤其是氧化LDL（OxLDL），导致泡沫细胞的形成和激活[3]。泡沫细胞持续分泌促炎细胞因子并产生活性氧（ROS），从而在斑块内放大炎症和氧化应激[4]，[5]。上述过程形成了一个恶性循环，导致巨噬细胞自噬功能障碍、巨噬细胞凋亡、坏死核心扩张和斑块不稳定，最终使斑块易于破裂和血栓形成[4]。鉴于这些病理特征，抗炎和抗氧化干预显示出良好的抗动脉粥样硬化效果[2]，[6]。

由于斑块内受损细胞功能无法得到充分恢复，调节斑块微环境通常被视为一种补充治疗策略。特别是巨噬细胞（斑块的主要细胞成分）的自噬缺陷已被确定为晚期动脉粥样硬化的标志。受损的自噬通过促进泡沫细胞的形成和凋亡、损害吞噬作用以及加剧炎症和氧化应激而加速斑块进展[4]，[7]，[8]。相反，将巨噬细胞自噬维持在最佳水平可以通过调节脂质代谢、缓解炎症和回收受损蛋白质和细胞器来提供动脉保护[9]。临床使用的免疫抑制剂雷帕霉素（rap）已被证明可以在动物模型中激活自噬并发挥多方面的动脉保护作用，包括免疫调节和抗炎[10]，[11]，[12]。然而，基于纳米粒子的雷帕霉素递送往往由于难以在斑块内同步多种治疗作用以及全身性不良反应（如血脂异常和mTORC2抑制）而效果不佳[13]，[14]。由于缺陷性自噬与氧化应激密切相关[4]，开发能够同时诱导巨噬细胞自噬并缓解氧化应激的纳米疗法代表了临床动脉粥样硬化管理的一个非常有前景的策略。

为了获得显著的治疗效果，纳米疗法必须在粒子大小、循环行为和斑块靶向能力方面进行智能设计[11]，[15]，[16]，[17]。已经提出了几种设计原则：(i) 结合主动或顺序靶向策略，例如利用透明质酸介导的内皮靶向和apoA-I介导的巨噬细胞靶向的核心-壳纳米平台[18]；(ii) 优化粒子大小以平衡循环寿命和组织渗透性，因为小于40纳米的粒子可以渗透斑块组织但会被迅速清除，而100-200纳米的粒子循环时间较长但深层渗透能力有限[19]，[20]，[21]；(iii) 将细胞靶向治疗（如降低胆固醇、抑制OxLDL摄取、增强吞噬作用）与斑块微环境调节（如清除ROS、缓解炎症、输送氧气）相结合[6]，[17]，[22]，[23]，[24]，[25]。这些挑战突显了需要开发能够结合顺序靶向和多模式治疗功能的尺寸可变纳米系统，以实现有效的斑块稳定和消退。

在这里，我们提出了一种多功能尺寸可变纳米组装系统（RT-rHDL），它通过延长循环时间、顺序靶向受损内皮和泡沫细胞、清除ROS、穿透斑块以及激活巨噬细胞自噬来协同对抗动脉粥样硬化（图1）。该系统基于右旋糖酐，这是一种临床常用的多糖，对CD44和VCAM-1受体具有高亲和力[26]，并经过抗氧化剂tempol和ROS可切割的硫酮键修饰。这种修饰使右旋糖酐带有正电荷、内在的抗氧化活性和ROS响应性，从而能够使载有雷帕霉素的重构HDL（RC-rHDL）通过静电作用组装成较大的RT-rHDL纳米组装体。在斑块内暴露于ROS时，RT-rHDL解体释放出小分子的RC-rHDL颗粒，这些颗粒深入斑块并将雷帕霉素递送给巨噬细胞，同时缓解氧化应激。在动脉粥样硬化小鼠中，RT-rHDL治疗显著减少了斑块负担和坏死核心的形成，缓解了局部炎症，并增强了斑块稳定性，证明了通过缓解氧化应激和激活自噬的强大治疗协同作用。

章节片段

材料

雷帕霉素（rap，≥98.0%）、tempol（tpl，≥98.0%）和右旋糖酐（DEX，10000 Da）购自Aladdin有限公司（上海，中国）。维生素E聚乙二醇琥珀酸-β-环糊精（TPGS-CD）的合成方法如先前报道[23]。其他材料列在补充数据中。

右旋糖酐-硫酮-tempol（DKT）的合成

右旋糖酐-tempol（DET）的合成：通过酯化反应合成了tpl功能化的DEX。简要来说，172.2 mg的tpl分散在无水DCM中，并加入CDI（3.0 mmol）

DET和DKT的表征

为了靶向治疗动脉粥样硬化，我们按照方案S1（支持数据）合理设计并合成了阳离子抗氧化剂右旋糖酐（DKT）。首先在CDI的催化下，将活性氧（ROS）清除剂tempol（tpl）与右旋糖酐（DEX）结合，生成右旋糖酐-tempol（DET）。如图1A所示，4.80–5.30 ppm和3.30–4.00 ppm的峰分别对应于DEX的半缩醛氢和残余骨架氢。然后，甲基质子

结论

总之，尺寸可变的RT-rHDL纳米组装体可以通过选择性地结合受损内皮细胞上的CD44受体和VCAM-1受体，在斑块内靶向积聚，这得益于其较长的血液循环时间和靶向能力。RT-rHDL纳米组装体的ROS触发解体导致小分子的RC-rHDL释放，同时结合了斑块内的ROS清除，随后RC-rHDL靶向渗透到斑块深处

CRediT作者贡献声明

王彦彦：撰写——原始草稿、方法学、研究、资金获取、概念化。齐凯顺：方法学、研究、正式分析、数据管理。李悠悠：方法学、研究、正式分析、数据管理。魏瑞瑞：方法学、研究、正式分析、数据管理。娄远达：方法学、研究、正式分析、数据管理。刘敏：方法学、研究、正式分析、数据管理。魏胜江：方法学，

利益冲突声明

作者声明没有竞争性财务利益。

致谢

本项目得到了国家自然科学基金（编号：82304427、82470351和82202321）和河南省高校重点科研项目（编号：24A350005）的财政支持。