巨噬细胞诱导型C型凝集素受体刺激糖脂的鉴定：来自植物乳杆菌OLL2712诱导树突状细胞产生IL-10

《Journal of Dairy Science》：Identification of macrophage-inducible C-type lectin receptor stimulatory glycolipids from Lactiplantibacillus plantarum OLL2712 that induce IL-10 production in dendritic cells

　　

植物乳杆菌_OLL2712是一种最初因其能强烈诱导先天免疫细胞产生白细胞介素10（IL-10）而被筛选出的乳酸菌。研究人员近期发现，这种IL-10的诱导作用是由树突状细胞中巨噬细胞诱导型C型凝集素受体（Mincle）与Toll样受体2（TLR2）共刺激介导的。本研究旨在鉴定_OLL2712中刺激Mincle的配体。研究人员从细菌细胞中提取脂质成分，通过高效液相色谱（HPLC）进行分级，并采用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）进行分析。研究人员鉴定出单葡萄糖基二酰甘油（MGDG）是在脱曼罗戈莎夏尔普（MRS）培养基中培养的细菌细胞中激活Mincle的化合物。与TLR2配体的共刺激显著增强了IL-10的产生。研究人员分析了在乳制品培养基中培养的细菌细胞（其表现出更强的IL-10诱导能力）与在MRS培养基中培养的细菌细胞相比，发现了葡萄糖脑苷脂（GlcCer）作为额外的Mincle配体。该物质很可能源自乳制品培养基，并在_OLL2712培养过程中吸附在其细胞表面；GlcCer也作为Mincle激动剂发挥作用，并与TLR2信号协同进一步增强了IL-10的产生。这些结果表明，MGDG和GlcCer共同促进了由_OLL2712诱导的树突状细胞产生IL-10。

乳酸菌因其潜在的健康促进效应，特别是调节免疫系统的能力，而引起了广泛关注。例如，某些乳酸菌通过诱导IL-10和调节性T细胞发挥免疫调节作用，被认为有助于管理自身免疫性疾病、过敏和炎症性肠病。此外，它们通过激活T辅助1型细胞和自然杀伤细胞产生的免疫刺激效应，有助于消除感染和癌细胞。然而，仅有少数致病物质被鉴定出来，因此关于导致这些免疫反应差异的原因仍存在许多未解之谜。植物乳杆菌_OLL2712（_OLL2712）， formerly classified as Lactobacillus plantarum，此前因其能在小鼠骨髓源性树突状细胞（BMDCs）和腹膜巨噬细胞中诱导IL-10而被筛选出来。IL-10是一种众所周知的抗炎细胞因子。该菌株的特点包括：热处理形式比活菌形式具有更强的IL-10诱导能力，且IL-10诱导能力因培养条件而异。此外，最近的研究显示，该菌株在人体试验中表现出改善葡萄糖和脂质代谢的能力。由于葡萄糖和脂质代谢障碍的标志是慢性低度炎症，IL-10的抗炎作用似乎有助于缓解这些代谢紊乱。研究人员先前发现，TLR2参与小鼠BMDC中由_OLL2712产生的IL-10，该过程通过从_OLL2712提取的脂磷壁酸（LTA）介导。然而，仅TLR2刺激不能促进IL-10产生，因此研究人员探索了新的受体并阐明了巨噬细胞诱导型C型凝集素（Mincle）的参与。进一步证明，_OLL2712衍生的LTA激活TLR2信号，从而诱导Mincle表达，而TLR2和Mincle的共刺激促进IL-10产生，揭示了Mincle刺激在IL-10产生中的重要作用。Mincle是一种C型凝集素受体，识别病原体相关分子。尽管已发现许多糖脂配体及其化学结构，但乳酸菌中Mincle配体的全谱系仍 largely unknown。因此，鉴定这些新型配体是阐明其免疫调节作用机制的有价值研究领域。本研究旨在鉴定_OLL2712中的Mincle配体并阐明其在IL-10产生中的参与，从而为_OLL2712发挥代谢改善作用的机制提供见解。

研究人员为开展研究用到的主要关键的技术方法如下：首先，使用脱曼罗戈莎夏尔普（MRS）培养基和乳制品培养基（脱脂牛奶基）培养_OLL2712样本队列；其次，通过氯仿:甲醇:水体系提取细菌细胞的脂质成分；接着，利用配备蒸发光散射检测器的高效液相色谱（HPLC）对粗提物进行分级分离；随后，采用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）及核磁共振（NMR）技术对分离的提取物进行结构分析；最后，利用表达Mincle和TLR2的报告细胞系（tsDC、2B4 reporter cells、HEK293 reporter cells）通过流式细胞术和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测配体活性及IL-10的产生水平。

研究结果部分首先对_{L. plantarum O}LL2712粗提物进行了免疫学表征。研究人员观察到，完整的_OLL2712细胞以浓度依赖性方式诱导tsDC产生IL-10。经相分离后，氯仿:甲醇（C:M）相中含有强烈的IL-10诱导活性。尽管C:M层保留了显著的TLR2配体活性，但未能直接刺激Mincle报告细胞，这表明Mincle配体可能以结合形式存在或需特定条件激活。随后，研究人员纯化了在MRS培养基中培养的_{L. plantarum O}LL2712提取物。通过HPLC分级和Mincle报告细胞筛选，发现第5组分具有Mincle配体活性。LC-MS/MS分析显示该组分富含多种单葡萄糖基二酰甘油（MGDG）物种。研究人员使用化学合成的MGDG（16:0/18:1）证实了其能触发强烈的剂量依赖性Mincle激活。当MGDG与TLR2激动剂Pam3CSK4联合使用时，显著增强了IL-10的产生，表明MGDG能激活TLR2-Mincle协同通路。最后，研究人员分析了在乳制品培养基中培养的_{L. plantarum O}LL2712的Mincle配体及其对IL-10产生的影响。结果显示，乳制品培养基培养的_OLL2712诱导IL-10的能力显著强于MRS培养基培养的菌株。在乳制品培养基提取物的第5组分中，除了MGDG外，还检测到了一硝基鞘氨醇（HexCer）。鉴于哺乳动物牛奶中HexCer主要为葡萄糖脑苷脂（GlcCer），且原核生物通常缺乏合成鞘脂的能力，研究人员推断这些GlcCer源自乳制品培养基并吸附在细菌表面。报告细胞实验证实，牛奶衍生的GlcCer能激活Mincle。当GlcCer与TLR2激动剂联合使用时，也显著增强了IL-10的产生，且与低浓度MGDG共刺激时效果进一步增强。这表明MGDG和GlcCer的共存构成了乳制品培养基培养_OLL2712优越IL-10诱导能力的基础。

在讨论部分，研究人员指出MGDG和GlcCer是_OLL2712的固有Mincle配体，其通过与TLR2激活结合，协同增强了体外IL-10的产生，为_OLL2712的免疫调节作用提供了机制基础。研究强调，尽管以往对Mincle配体（如结核分枝杆菌的TDM）的研究多关注促炎反应，但本研究揭示了_OLL2712中的分子能激活Mincle并促进抗炎细胞因子环境。MGDG可能是作为TLR2配体LTA的脂质锚定物，在噬菌体 Processing过程中被释放并激活Mincle。此外，GlcCer并非细菌合成，而是源自乳制品培养基并吸附于细胞表面。这种独特的配体组合机制可能解释了_OLL2712在改善肠道稳态和代谢方面的体内益处。

结论部分：本研究利用_{L. plantarum O}LL2712，鉴定出MGDG和GlcCer为Mincle配体。MGDG似乎是细菌固有的糖脂，而GlcCer很可能源自乳制品培养基。重要的是，这两种Mincle配体与TLR2信号协同作用，增强了IL-10的产生。鉴于_OLL2712最初被鉴定为一种能在树突状细胞中强效诱导IL-10产生的乳酸菌，研究结果强烈表明，固有的细菌MGDG以及在存在时源自培养基的GlcCer是该菌株抗炎活性的主要功能分子。