优化堆肥过程，以减少质粒和整合性接合元件的传播，从而降低牲畜粪便中的抗生素抗性基因组含量，确保有机肥的安全使用

《Journal of Hazardous Materials》：Optimising composting to reduce plasmid and integrative conjugative element conjugation to minimise antibiotic resistomes in livestock manure for safe organic fertilisation

　　

徐志成|张兰霞|朱东|支素丽|尼古拉斯·阿什博尔特|李国学|罗文海|阮龙德

摘要

抗菌素耐药性是通过堆肥利用畜禽粪便生产有机肥料的一个关键威胁。本研究提供了关于堆肥过程中抗菌素耐药基因（ARGs）动态的新见解，以提出消除这些基因的策略。基因组解析宏基因组学、元分析和定量评估的结果表明，温度和含水量是影响堆肥过程中ARGs动态的关键因素。尽管某些嗜热细菌可以转移整合接合元件（ICE），但将堆肥温度提高到60°C以上可以减少由质粒接合驱动的移动性ARGs的传播。进一步将含水量控制在60%以下可以抑制细胞外聚合物的分泌，从而限制ICE接合引起的ARGs反弹，尤其是在堆肥成熟阶段。这些结果对中国尤为重要，因为中国91.5%的畜禽粪便来源的ARGs来自猪粪。将本研究的结果应用于优化畜禽粪便的堆肥过程，可以将ARGs的增殖减少多达59.3%。

引言

有机肥料对全球可持续农业至关重要，可以提高生产效率并减少农业对环境的影响[3]，[42]。畜禽粪便是有机肥料生产的主要原料[78]；然而，由于在动物饲料中广泛使用抗菌剂，其中含有抗菌决定因子（如抗生素、抗生素耐药基因（ARGs）和抗菌素耐药性的细菌载体（AMR），因此引发了环境问题[28]，[57]，[59]。减少畜牧业中抗生素的使用是限制AMR和ARGs出现和传播的关键策略。此外，管理与畜禽粪便相关的AMR仍然是一个重大挑战[62]。如果管理不当，动物粪便可能会将耐药决定因子传播到自然环境中，对食品安全和公共卫生构成风险[54]。

总体而言，有机肥料是土壤中ARGs积累的重要来源和载体，这些ARGs可以通过食物链传播，危害人类健康，并威胁传染病的临床治疗效果和公共安全[55]，[62]。堆肥是管理畜禽粪便和回收有机肥料资源最常用的方法。例如，在中国，大约90%的畜禽粪便被用于堆肥[21]。在堆肥过程中，有机物分解产生热量，使病原体失活，并支持能够降解抗生素的嗜热微生物的生长。嗜热条件和生物降解还会产生游离氨，进一步增强病原体的失活效果[25]。

畜禽粪便是ARGs增殖的热点，因此近年来人们越来越关注堆肥过程中ARGs的演变和去除[11]。通常在嗜热阶段ARGs的数量会减少，但在冷却和成熟阶段可能会反弹[71]。堆肥在减少ARGs方面的效果取决于多种因素，包括混合、通风和操作条件[15]，[16]，这些因素可能会抑制或促进ARGs的增殖。

最近的研究探讨了微生物相互作用，以了解堆肥过程中的ARG动态，重点关注由移动遗传元件（MGEs）介导的水平基因转移（HGT）作为ARG转移的关键机制[43]，[50]。这些研究通常结合使用聚合酶链反应（qPCR）、16S rRNA基因扩增子测序和基于相关性的统计分析方法（如网络分析和结构方程模型）[12]，[41]，[71]。王等人[60]发现，耐热/嗜热菌属如Romboutsia、Clostridisensu_stricto_1和Terrisporobacter是主要的ARG和MGE宿主，可能在猪粪堆肥过程中起主导作用。廖等人[37]表明，超嗜热条件（>80°C）显著降低了ARG宿主的多样性和数量，去除了49%的MGEs和89%的ARGs。

尽管最近有专门的研究工作，但由于异质堆肥基质的代表性采样困难以及缺乏直接证据，基于相关性的分析方法的可靠性仍存在不确定性。此外，MGEs在堆肥各阶段（中温、嗜热、冷却和成熟阶段）中的作用仍不甚明了，而这些阶段的条件变化很大（如温度、含水量、pH值和化学压力）。这些知识空白阻碍了我们解释ARG去除变化的能力，以及精确优化堆肥过程以生产安全有机肥料。

有多种堆肥策略可用于减少有机肥料中的ARGs。然而，它们的有效性在不同条件下有所不同，部分原因是缺乏关键的调控指标和相应的标准范围。关键的是，堆肥防止ARGs通过有机肥料传播的能力尚未得到量化。这种科学证据的缺乏阻碍了制定国家或地区政策来标准化堆肥操作，以确保公共安全和可持续农业的发展。

本研究结合了实验研究和全球元分析，阐明了畜禽粪便堆肥过程中ARG演变的潜在机制。宏基因组分析用于识别关键调控因素，并在群体水平上追踪ARGs、MGEs及其在质粒和染色体中的共存情况。基因组解析宏基因组学进一步揭示了细菌基因组之间的潜在HGT事件。全球元分析描述了不同堆肥阶段的ARG动态和去除模式。此外，通过一个来自中国的案例研究，量化了堆肥减少有机肥料向农业土壤传播ARGs的潜力。总体而言，这些发现为制定安全可持续使用有机肥料的有效策略提供了重要见解。

章节摘录

堆肥材料

本研究使用来自北京（中国）当地农场的新鲜猪粪和禽粪作为代表性的堆肥原料，以研究堆肥过程中的ARG动态。这些粪便是以往关于抗生素和ARGs存在的研究中最常研究的对象（图S17&S18）。猪肉和禽肉是全球食品供应链中最重要的两种肉类产品。空气干燥的玉米秸秆（来自北京的一个当地农场）被用作所有堆肥实验的填充剂。

堆肥中的关键物理化学性质、ARGs和MGEs

所有堆肥实验都经历了四个不同的阶段：中温、嗜热、冷却和成熟（图1A）。在早期阶段，易生物降解的有机物（如碳水化合物、蛋白质和脂类）被好氧菌迅速分解，通过生化代谢产生热量。因此，温度上升到60°C以上，而氧气含量降至10-15%（v/v），随着过程从中温阶段过渡到嗜热阶段（图1A）。

氨排放——

讨论

在畜牧业中，抗生素的治疗和促进生长的用途是通过粪便、堆肥和有机肥料传播ARGs的主要驱动因素，对生态系统和人类健康构成风险[32]，[55]，[80]。元分析结果显示，四环素、磺胺类、大环内酯类和氟喹诺酮类在畜禽粪便中的含量平均为44.8毫克/千克，导致相应的ARGs富集（图S15&S16）。

抗生素作为强烈的选择压力，促进了

结论

本研究结果表明，畜禽粪便堆肥过程中ARGs的去除主要受中温到嗜热阶段的温度和冷却到成熟阶段的含水量控制。具体来说，将温度提高到60°C以上可以有效抑制由质粒接合介导的移动性ARGs的水平转移。进一步将含水量控制在60%以下可以抑制EPS的分泌，从而限制ICE驱动的ARGs反弹。

环境影响

堆肥是减少ARGs的重要手段，从而确保有机肥料的绿色和可持续农业发展。研究表明，在堆肥过程中控制温度和含水量可以限制基因转移，有助于降低来自畜禽粪便的有机肥料中的抗菌素耐药性风险。因此，推进堆肥技术对于最小化ARG风险和促进生态安全的农业发展至关重要。

CRediT作者贡献声明

阮龙德：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、监督、资源获取、正式分析、概念化。徐志成：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、调查、正式分析、数据管理。张兰霞：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、调查、正式分析、数据管理。朱东：撰写——初稿、验证、概念化。罗文海：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2023YFD1702000）、中国国家创新人才博士后计划（BX20230421）、中国博士后科学基金会（2023M733789）、UTS-CAU联合研究生培训计划以及澳大利亚农业、食品和环境抗菌素耐药性解决合作研究中心（SAAFE-CRC, S032）的支持。此外，作者还要感谢夏若涵对数据贡献的支持