《Journal of Virological Methods》：A rapid detection method for African swine fever virus antigens in serum and whole blood samples using an automated machine reading tool for lateral flow assays
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非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种严重疾病。在现场条件下，ASFV的检测可通过床边检测实现，包括靶向病毒抗原的侧向层析检测（LFA）。在本研究中，研究人员测试了一种用于检测全血和血清中ASFV抗原的LFA（一种ASFV Ag LFA）。作
非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种严重疾病。在现场条件下，ASFV的检测可通过床边检测实现，包括靶向病毒抗原的侧向层析检测（LFA）。在本研究中，研究人员测试了一种用于检测全血和血清中ASFV抗原的LFA（一种ASFV Ag LFA）。作为一种新颖特征，研究人员将ASFV Ag LFA与一种快速诊断设备iaX读取器（iaX reader）结合使用，该读取器可生成ASFV抗原水平的定量结果。与qPCR相比，ASFV Ag LFA联合iaX读取器对血清的诊断灵敏度为100%（1.00，95%置信区间0.92-1.00），诊断特异性为91%（0.91，95%置信区间0.72-0.99）。对于全血，观察到的诊断灵敏度较低，为79%（0.79，95%置信区间0.63-0.90），而诊断特异性与血清相当，为95%（0.95，95%置信区间0.77-1.00）。当使用组内相关系数（ICC）估计比较定量一致性时，ASFV Ag LFA与ASFV qPCR对血清具有高度一致性，而对全血则观察到中等程度的一致性。Bland-Altman分析和回归分析表明，两种血液样本的一致性并非均匀一致，且在病毒水平较高时一致性最高。总之，LFA与诊断读取器的组合在血清样本中检测ASFV抗原的表现优于全血样本。
非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种严重出血性疾病，对全球养猪业造成巨大经济损失。目前，大多数受疫情影响地区缺乏有效疫苗，防控策略主要依赖早期检测和严格的管控措施。当前的金标准检测方法如qPCR需要实验室基础设施，而在偏远地区或现场条件下，床旁检测工具（如侧向层析检测，LFA）具有显著优势。然而，现有LFA通常只能提供定性结果，依赖肉眼判读，灵敏度和一致性有限。为此，研究人员开发了一种新型ASFV抗原LFA（NDx-ASFVControl），并首次将其与自动诊断读取器iaX reader（intelligent analyzer eXpress-2101）结合，旨在实现定量检测并提高性能。研究利用来自三项实验感染研究（Olesen et al., 2023, 2024, 2025）的猪血清和乙二胺四乙酸抗凝全血（EDTA-blood）样本，共65份血清和64份EDTA全血样本，其中包含经口或鼻内接种欧洲基因II型ASFV（ASFV POL/2015/Podlaskie毒株）的猪只样本。通过与qPCR（靶向P72基因）对比，研究人员评估了该系统的诊断灵敏度、特异性及定量一致性。结果表明，该组合系统对血清具有100%的灵敏度和91%的特异性，对全血具有79%的灵敏度和95%的特异性；定量分析显示血清样本的ICC（intraclass correlation coefficient，组内相关系数）达0.906（绝对一致性），全血样本为0.682，且Bland-Altman分析表明一致性在病毒载量高时最佳。研究发表在《Journal of Virological Methods》。
关键技术方法概述：研究人员从三项已发表的ASFV实验感染研究（Olesen et al., 2023, 2024, 2025）中获取血清和EDTA-blood样本，该毒株为ASFV POL/2015/Podlaskie（基因II型）。主要技术包括：（1）qPCR检测：采用MagNA Pure 96系统提取病毒DNA，以靶向ASFV P72基因的qPCR（Tignon et al., 2011）测定Ct值和基因组拷贝数，作为金标准；（2）LFA与iaX reader联合检测：将ASFV Ag LFA（NordicDx）与iaX reader（Assaya, USA）组合，通过可见光谱成像和校准曲线将LFA测试线强度转化为Ct等效值（LFA-iaX Ct-equivalent）。校准采用ASFV阳性血清或EDTA-blood的两倍稀释系列，并利用阴性样本计算检测限（LOD）。统计方法包括ICC、Bland-Altman分析和回归分析，评估定量一致性和比例偏差。
研究结果：
**血清样本**：通过稀释系列校准，LFA-iaX对血清的检测限（LOD）对应Ct 42.00（RI值0.96）。验证65份血清样本显示，qPCR阳性42份、阴性23份；LFA-iaX检测阳性44份、阴性21份，无假阴性，2份假阳性（RI值分别为1.08和1.00，接近LOD）。诊断灵敏度100%（95%CI 0.92-1.00），特异性91%（95%CI 0.72-0.99）。定量一致性分析显示，ICC为0.914（一致性）和0.906（绝对一致性），属优秀。Bland-Altman分析显示平均偏倚-0.95 Ct，MAE 2.22 Ct，RMSE 2.85 Ct，95% LoA从-6.28 Ct到4.38 Ct。回归分析表明比例偏差显著（斜率-0.232，p<0.001），在≤30 Ct区间偏差更为结构化（R
2=0.91），>30 Ct区间无显著关联。
**全血样本**：通过稀释系列校准，LFA-iaX对EDTA-blood的LOD对应Ct 29.44（RI值1.08）。验证64份EDTA-blood样本显示，qPCR阳性42份、阴性22份；LFA-iaX检测阳性34份、阴性30份，9份假阴性（7份Ct>30，2份Ct分别为23.85和26.67），1份假阳性（RI=1.13）。诊断灵敏度79%（95%CI 0.63-0.90），特异性95%（95%CI 0.77-1.00）。定量一致性分析显示，一致性ICC为0.819（良好），绝对一致性ICC为0.682（中等）。Bland-Altman分析显示平均偏倚2.44 Ct，MAE 3.02 Ct，RMSE 3.32 Ct，95% LoA从-2.03到6.91 Ct。回归分析显示全范围比例偏差显著（斜率-0.40，p<0.001），但按Ct分层后，≤25 Ct区间无显著偏差（斜率-0.27，p=0.194），>25 Ct区间有显著偏差（斜率-1.20，p=0.031，仅6个样本）。
**讨论总结**：研究指出LFA-iaX系统对血清的检测性能优于EDTA全血，血清样本的病毒抗原检测更灵敏、定量一致性更优。这可能与ASFV与红细胞结合有关，使全血中抗原可及性较低。尽管全血更易于现场使用，但血清可通过自然凝血分离而无需离心。高于30 Ct的样本假阴性风险增加，与既往研究一致。在高病毒载量（低Ct）样本中，iaX reader有时因“钩状效应”给出无效结果（控制线弱），但目视检查仍可判读阳性。与肉眼判读相比，iaX reader提供了更高的灵敏度和定量能力，尤其对弱阳性样本。研究强调，在田间场景中，该系统适用于临床症状明显的病猪或死猪检测，此时病毒载量通常较高。
**研究结论**：综上所述，使用新开发的ASFV抗原LFA（NDx-ASFVControl）并结合iaX快速诊断读取器，研究人员报告了对血清样本的高灵敏度和特异性，而对EDTA全血的灵敏度和特异性与既往研究相当。该LFA对血清的高灵敏度值得进一步探索，使用包含其他ASFV毒株的测试组，因为在本研究中使用感染ASFV POL/2015/Podlaskie毒株的猪只血液样本时，其在ASFV抗原检测中的表现优于EDTA全血。
