近期激活的细胞毒性淋巴细胞的空间聚类改善与高级别浆液性卵巢癌女性总生存期的关联

《Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention》：Spatial Clustering of Recently Activated Cytotoxic Lymphocytes Improves Association with Overall Survival in Women with High-Grade Serous Ovarian Cancer Open Access

　　

背景：先前的一项研究发现，将肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的空间背景信息添加到丰度中，改善了非西班牙裔黑人女性高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）总生存期（OS）的关联。本研究旨在以非西班牙裔白人女性为主的HGSOC队列中复制先前的发现。方法：采用多标免疫荧光（mIF）技术对来自三项流行病学研究（N = 433）的HGSOC女性患者的TIL进行表征。通过Ripley K的置换方法推导TIL的空间聚类。使用Cox比例风险模型分析空间聚类和丰度与OS的关联。结果：在评估TIL丰度高（>1%）的肿瘤内空间聚类差异的模型中，研究人员发现空间信息显著改善了近期激活的CTL的模型拟合度（似然比检验P = 0.008），其中高丰度下的低空间聚类与死亡风险降低相关（风险比 = 0.31；95%置信区间，0.14–0.70；P = 0.004），相较于近期激活的CTL高度聚类时。结论：在这项研究中，研究人员通过纳入近期激活的CTL的空间信息，复制了在白人女性为主的HGSOC中OS关联的显著改善。需要进一步研究以了解近期激活的空间结构影响HGSOC生存的机制。影响：本研究验证了研究人员先前的发现，即在执行生存分析时将空间背景信息添加到丰度中，特别是针对CTL或近期激活的CTL，能改善模型拟合度。

论文解读文章

研究背景

高级别浆液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer, HGSOC）是最常见的上皮性卵巢癌类型，占卵巢癌相关死亡的75%，通常因非特异性症状而在晚期才被诊断。尽管近年来在治疗上引入了聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂和抗VEGF疗法，但总生存期（overall survival, OS）并未显著改善，因为这些治疗仅惠及部分患者。此外，免疫检查点抑制剂（如pembrolizumab）在卵巢癌中的总体缓解率仍然较低。肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes, TIL）的存在与更长的无进展生存期和OS相关，且其空间位置的重要性已被证实，例如细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTL；CD3⁺CD8⁺）存在于肿瘤区室而非基质时OS改善。然而，对于免疫细胞聚类与OS的关联在卵巢癌中尚未充分探索。先前一项针对非西班牙裔黑人女性HGSOC队列的研究发现，在丰度基础上加入TIL和CTL的空间背景信息可改善与OS的关联。基于此，研究人员旨在主要针对非西班牙裔白人女性HGSOC队列中复制这一发现。

研究人员开展的研究与结论

研究人员利用三项大型流行病学研究——护士健康研究（Nurses’ Health Study, NHS）、护士健康研究II（Nurses’ Health Study II, NHSII）和新英格兰病例对照研究（New England Case-Control Study, NECC）——共纳入433例HGSOC患者（其中NECC=175，NHS=207，NHSII=51）。通过多标免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）对组织芯片（tissue microarray, TMA）进行染色，检测T细胞标记物（CD3、CD4、CD8、CD69、FOXP3），并使用基于Ripley K的置换方法量化单细胞表型或双细胞表型（共定位）的空间聚类程度。采用Cox比例风险模型评估空间聚类和丰度与OS的关联，调整诊断年份、年龄、分期和队列。在丰度高的样本中（>1%），加入空间信息显著改善了近期激活的CTL（CD3⁺CD8⁺CD69⁺）的模型拟合度（似然比检验P = 0.008），且低空间聚类与死亡风险降低相关（HR=0.31；95% CI，0.14–0.70；P=0.004）。然而，对于其他T细胞亚型（如总体TIL、辅助性T细胞（CD3⁺CD4⁺）、调节性T细胞（Tregs，CD3⁺CD4⁺Foxp3⁺）），加入空间信息未显著改善模型（P>0.01）。此外，在双细胞共定位分析中，近期激活的CTL与辅助性T细胞的共聚类与OS的关联也未达到显著性阈值（P=0.019>0.01）。敏感性分析在限制非西班牙裔白人女性或排除采集超过30年的样本后，结果趋势一致。本研究发表在《Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention》。

主要关键的技术方法

本研究的关键技术方法包括：1）样本队列：来自NHS、NHSII和NECC三项流行病学研究，共433例HGSOC女性患者；2）免疫检测：采用多标免疫荧光（mIF）对组织芯片（TMA）进行染色，使用Opal 7-Color自动化IHC试剂盒，标记物包括CD3、CD4、CD8、CD69和FOXP3，并由DAPI和pan-cytokeratin分别用于核检测和肿瘤/基质分割；3）空间度量：通过Ripley K的置换方法（R包spatialTIME）计算单细胞或双细胞表型的空间聚类程度，设定半径为150像素（约75 μm），基于100次置换评估完全空间随机性（CSR）；4）统计分析：使用Cox比例风险模型，将丰度和空间聚类分为五级（缺失、低丰度/低聚类、低丰度/高聚类、高丰度/低聚类、高丰度/高聚类），通过似然比检验（LRT）比较加入空间信息后的模型拟合改善。

研究结果

核心水平丰度

在433例患者的1244个TMA核心中，CD3标记物在>90%核心中阳性，其中83.9%有足够阳性细胞计算空间聚类。CTL和近期激活的CTL阳性比例分别为75.6%和60.5%。辅助性T细胞（Th，CD3⁺CD4⁺）和调节性T细胞（Tregs）的阳性比例较低（51.3%和39.8%）。通过描述性统计展示了各队列患者的年龄、分期、种族和随访时间分布。

单细胞表型空间聚类与生存的关联

对所有标记物组合，包含丰度和空间聚类五级分类的模型与仅含临床信息的模型相比，无显著改善（总体LRT P值均>0.01）。但近期激活的CTL表现出最大的生存收益趋势（P=0.025）。在高丰度样本（>1%）中，近期激活的CTL的空间聚类水平显著改善了模型拟合（LRT P=0.003），且低聚类相比于高聚类与更长的OS相关（HR=0.31，P=0.004）。其他细胞类型（TIL、Tregs、CTL）的改善未达到显著性阈值（P<0.01）。

共定位与生存的关联

测试了CTL或近期激活的CTL与Th细胞（CD3⁺CD4⁺）、近期激活的Th细胞（CD3⁺CD4⁺CD69⁺）、Tregs的共定位，未发现任何细胞对组合的丰度/共定位五级分类与OS显著关联（P>0.01）。在仅包含共定位可计算的核心（两标记物均存在）中，近期激活的CTL与Th细胞的共聚类改善最大（LRT P=0.019），但仍未达阈值。

敏感性分析

限制非西班牙裔白人女性后，总体趋势相似，但CTL在加入空间信息后模型拟合改善显著（LRT P=0.001），而全样本分析中不显著（P=0.033）。排除采集超过30年的样本后结果稳健。

讨论与结论

讨论部分指出，尽管本研究未在大多数T细胞亚型中观察到空间聚类与OS的显著关联，但近期激活的CTL在丰度高时低空间聚类伴有更好生存，这与先前在非西班牙裔黑人女性中的发现一致。可能的原因包括队列组成差异（种族、样本处理批次效应）或统计功效不足。研究假设低空间聚类可能代表更广泛的抗肿瘤免疫反应，或与干样CTL的分布有关。此外，空间聚类可能作为肿瘤微环境结构差异的替代指标。未来需要更大队列研究其他T细胞亚型（如组织驻留记忆细胞）的分布，以及优化Ripley K的搜索半径。结论部分翻译如下：总之，本研究支持为HGSOC开发预后生物标志物，这些标志物应同时考虑免疫细胞在肿瘤微环境（TIME）中的丰度和空间背景，而非仅考虑丰度。