《Cancer Immunology Research》：Potent Cytotoxic Tumor-Infiltrating Lymphocytes Can Be Generated from Immune-Excluded Chondrosarcomas Using Regulatable Membrane-Bound IL15
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自体肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs）细胞疗法在黑色素瘤、宫颈癌和肾癌等免疫学“热”肿瘤中展现出有前景的疗效。然而，从突变负荷低的“冷”肿瘤（如多种肉瘤类型）中生成杀伤性TILs面临挑战，主要归因于肿瘤
自体肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs）细胞疗法在黑色素瘤、宫颈癌和肾癌等免疫学“热”肿瘤中展现出有前景的疗效。然而，从突变负荷低的“冷”肿瘤（如多种肉瘤类型）中生成杀伤性TILs面临挑战，主要归因于肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中淋巴细胞浸润有限、肿瘤抗原特异性高亲和力T细胞频率低，以及TME中存在的免疫耐药机制尚未完全阐明。在此，研究人员报告了从主要由胶原基质组成、细胞稀少的免疫排除型软骨肉瘤活检样本中，成功生成并扩增生殖可调控膜结合白细胞介素-15（Membrane-bound IL15, mbIL15）的工程化TILs（cytoTIL15细胞）。研究证明，这些细胞在无外源性白细胞介素-2（Interleukin-2, IL2）的情况下，在体外培养和肿瘤球体模型中具有强效的肿瘤杀伤能力。对TME的全面空间谱系分析揭示，胶原的普遍存在和髓系细胞浸润是主要的耐药机制，而淋巴细胞浸润主要局限于肿瘤的外周区域，这对采集此类肿瘤TILs具有相关指导意义。此外，研究人员证明，IL-15降低了从TIL克隆型中分离出的T细胞受体（T-Cell Receptor, TCR）的信号阈值，从而增加了其在自体3D肿瘤模型中的浸润性和细胞毒性。这些结果表明，为免疫排除型肿瘤患者开发一种有效的无IL2 TIL疗法的可能性。
自体肿瘤浸润淋巴细胞（Tumor-Infiltrating Lymphocytes, TILs）细胞疗法作为一种强效的细胞治疗手段，已在多种免疫炎症性实体瘤中诱导持久的疾病缓解，并 recently 获得美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准用于治疗黑色素瘤，成为首个获批用于实体瘤的细胞疗法产品。然而，对于免疫原性较低、突变负荷低、TME中T细胞匮乏且缺乏肿瘤抗原的“冷”肿瘤（如大多数肉瘤），TIL疗法的有效性尚不明确，且常因TME中复杂的免疫抑制机制而面临挑战。尽管已有工程化TILs的尝试，但部分方法存在安全性问题或制造复杂性。鉴于软骨肉瘤作为一种成人常见的骨癌，目前缺乏FDA批准的疗法，且化疗效果有限，其对免疫检查点抑制剂反应率低，属于典型的免疫排除型肿瘤。本研究旨在评估研究人员先前开发的无IL2 TIL快速扩增流程——即通过工程化可调控mbIL15并结合表达mbIL21和4-1BB配体（4-1BB Ligand）的饲养细胞——是否能够从免疫排除、基质占主导的软骨肉瘤中成功生成具有临床潜力的cytoTIL15细胞，并深入解析软骨肉瘤TME的特征及其免疫排除机制。
为开展这项研究，研究人员主要采用了以下关键技术与方法：首先，收集了24例常规软骨肉瘤患者的福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded, FFPE）组织样本及新鲜肿瘤样本，部分样本来源于西北大学（Northwestern University）组织档案，另有黑色素瘤样本来自合作人体组织网络（Cooperative Human Tissue Network）。其次，利用免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）、NanoString nCounter批量RNA测序、T细胞受体（T-Cell Receptor, TCR）测序以及GeoMx数字空间谱系（Digital Spatial Profiling, DSP）技术对TME进行多维度的分子和空间特征分析。再次，采用两步法扩增流程：预快速扩增程序（Pre-Rapid Expansion Protocol, pre-REP）中引入4-1BB激动剂以优化TIL生成，随后进行快速扩增程序（REP），通过慢病毒转导将可调控mbIL15基因导入TILs，并使用工程化饲养细胞进行扩增。最后，通过构建自体患者来源的3D肿瘤球体模型（Patient-Derived 3D Tumor Spheroids），结合活细胞成像、免疫荧光染色及磷酸化ERK检测，评估cytoTIL15细胞的细胞毒性、浸润能力及TCR信号阈值调节机制。
在研究结果方面，研究人员首先对软骨肉瘤TME进行了全面表征。通过IHC、NanoString分析及GeoMx DSP技术，研究证实软骨肉瘤是典型的免疫排除型肿瘤。空间分析显示，CD3+ T细胞和CD68+髓系细胞主要富集在肿瘤周边区域，而肿瘤核心区域浸润极少。TCR测序进一步证实，周边区域的TCR多样性显著高于肿瘤内部。研究还发现，肿瘤相关抗原（如MAGEC1）的表达与肿瘤内CD8+ T细胞浸润正相关，而纤维化和细胞外基质调节因子（如CDH2, CDH11）的高表达与免疫排除表型相关，表明胶原基质可能是免疫排除的主要机制。
其次，研究人员成功从软骨肉瘤患者样本中生成了cytoTIL15细胞。尽管初始肿瘤中T细胞浸润极少，但通过在pre-REP步骤中加入4-1BB激动剂，研究人员显著提高了TIL的获取产量。扩增后的cytoTIL15细胞主要 enriched 为CD8+ T细胞，表现出较弱的 exhaustion 表型（PD-1表达较低）和较高的记忆表型标志物（CD25, CD27）。在功能评估中，cytoTIL15细胞在无IL2的情况下展现出多效性，并能分泌高水平的IFNγ。
最后，研究人员评估了cytoTIL15细胞的抗肿瘤活性及其机制。在2D共培养中，cytoTIL15细胞对自体肿瘤细胞系的杀伤作用显著优于未工程化的TILs，且该杀伤作用呈乙唑胺（Acetazolamide, ACZ）剂量依赖性，证实了mbIL15的作用。在更接近生理状态的3D肿瘤球体模型中，cytoTIL15细胞显示出更强的浸润能力和深层杀伤能力，表达颗粒酶B（Granzyme B, GZMB）的T细胞能深入球体内部。机制研究通过单细胞TCR测序识别出主要的低亲和力克隆型，并利用报告细胞系证明，外源性IL-15能以剂量依赖的方式降低TCR的信号阈值，促进ERK磷酸化，从而激活低亲和力TCR克隆型的抗肿瘤活性。
在讨论部分，研究人员指出，尽管软骨肉瘤具有免疫排除特征且细胞稀少，但通过优化pre-REP流程及cytoTIL15工程化策略，仍能有效生成具备高细胞毒性和多效性的TIL产品。这与之前在“热”肿瘤中的发现一致，表明mbIL15工程化不仅能提供无需IL2的扩增优势，还能通过降低TCR信号阈值，增强对低亲和力肿瘤抗原特异性T细胞的激活。研究特别强调了采样策略的重要性，建议在采集免疫排除型肿瘤时，应考虑采集周边富含免疫细胞的区域而非仅关注肿瘤核心。此外，研究发现软骨肉瘤中常伴有黏膜相关恒定T细胞（Mucosa-Associated Invariant T cells, MAIT）的浸润，这提示可能存在非经典的抗原呈递机制，值得进一步探索。尽管研究缺乏体内数据，但3D球体模型的结果支持了cytoTIL15疗法在软骨肉瘤及其他免疫排除型实体瘤中的临床潜力。论文结论部分明确指出，cytoTIL15细胞技术为开发针对免疫排除型肿瘤（如软骨肉瘤）的有效无IL2 TIL细胞疗法提供了坚实的科学依据和可行的路径，证明了IL15工程化在克服TME免疫抑制及增强T细胞功能方面具有关键意义。该研究结果对于拓展细胞疗法的适用范围具有重要意义。
