C型凝集素受体通过上调实现继发性免疫监视

《npj Gut and Liver》：Secondary Immune Surveillance via upregulation of C-type lectin receptors

　　

C型凝集素受体（C-type lectin receptors, CLRs）是一类模式识别受体（Pattern recognition receptors, PRRs），能够感知多种微生物相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）和损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns, DAMPs）。在酒精相关性肝炎（Alcohol-associated Hepatitis, AH）中，酒精摄入导致细菌脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）渗漏， Toll样受体4（Toll-like receptor 4, TLR4）信号通路通过上调CLR表达，增加了免疫系统可检测到的靶标多样性，研究人员将此过程称为“继发性免疫监视”。先前研究发现，人源单核细胞会对LPS/TLR4信号产生CLR上调反应，且在AH患者中表达显著升高。本研究旨在拓展对继发性免疫监视的理解。研究人员发现，多种TLR信号均可上调CLR表达。此外，小鼠单核细胞和小胶质细胞在响应LPS/TLR4信号时也会上调CLR表达。研究人员利用Mincle基因敲除小鼠（Mincle-KO mice）解析了单一CLR缺失对组织炎症的影响。结果显示，Mincle-KO小鼠对LPS引起的肝脏炎症具有保护作用，但脂肪组织炎症加重，提示损伤部位发生了转移。 bulk RNA测序（Bulk RNA sequencing, Bulk RNA-seq）揭示了许多CLR基因存在广泛的 alternative splicing，且在LPS刺激后仅检测到可翻译的mRNA。最后，通过对AH患者肝脏bulk RNA-seq数据的分析，研究人员观察到CLR的大量表达，表明这些受体可能是减少炎症的潜在治疗靶点。

**论文解读：C型凝集素受体介导的继发性免疫监视及其在肝脏与脂肪组织炎症中的差异化作用**

慢性肝脏疾病通常伴随代谢通路功能障碍、再生能力降低以及免疫细胞向肝实质的大量浸润。酒精相关性肝病（Alcohol-associated Liver Disease, ALD）是一组改变肝脏代谢、再生和先天免疫功能的疾病谱系。在极端的临床表型如酒精相关性肝炎（Alcohol-associated Hepatitis, AH）中，浸润的免疫细胞急剧增加肝脏炎症，导致肝细胞进一步损伤。AH的30天死亡率在所有慢性肝脏疾病中最高，且患者人数近年来呈上升趋势。目前，驱动该疾病中免疫细胞浸润的具体机制尚未完全阐明，亟需深入研究以寻找干预靶点。模式识别受体（Pattern recognition receptors, PRRs）在肝脏炎症反应及ALD和AH的发展中发挥关键作用。例如，TLR4感知饮酒期间从肠道渗漏的细菌LPS，抑制TLR4可减少肝脏炎症和损伤。Mincle作为PRR家族中的一种C型凝集素受体（C-type lectin receptors, CLRs），主要表达于单核细胞和巨噬细胞，能够感知由死亡肝细胞分泌的损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns, DAMPs）如SAP130，并驱动肝脏浸润。既往研究表明，Mincle-KO小鼠因免疫细胞向肝脏浸润减少而对ALD具有保护作用，且Mincle信号通过SYK通路，抑制SYK也可改善ALD，提示浸润的单核细胞本身不直接导致肝损伤，而是下游促炎基因表达导致了病理进程。

在此背景下，研究人员开展了这项研究，旨在拓展对继发性免疫监视的理解。继发性免疫监视是指当强效免疫激动剂（如LPS/TLR4信号）作为初级信号时，上调检测较少见PAMPs和DAMPs的CLR，从而感知并发组织损伤的过程。研究人员通过一系列实验揭示了CLR的调控机制、组织特异性表达及其在炎症中的复杂作用。

**主要技术方法**
研究人员利用THP1-Dual单核细胞系模拟人源免疫反应，通过qPCR和报告基因检测分析TLR激动剂对CLR表达及NF-κB/干扰素信号通路的影响。在小鼠模型中，研究人员使用低剂量LPS腹腔注射诱导急性炎症，结合Mincle-KO、杂合子（Het）和野生型（WT）小鼠，评估组织炎症差异。此外，利用公共单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE160450）和_bulk RNA-seq_数据（GSE75246, PRJNA531223等），分析小鼠单核细胞、小胶质细胞及AH患者肝脏组织的CLR表达谱和剪接模式。样本队列来源于小鼠模型及AH、非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）、丙型肝炎（HCV）等患者的肝脏组织。

**研究结果**
1. **Mincle和Dectin-3受NF-κB信号上调**：研究人员发现，多种TLR激动剂（如Pam3CSK4/TLR2, LPS/TLR4, R848/TLR7）主要通过NF-κB通路，剂量依赖性地上调Mincle、Dectin-3和Dectin-1的表达。相比之下，干扰素α仅上调干扰素通路，不影响CLR表达。此外，Mincle激动剂TDB可通过SYK信号同时激活NF-κB和干扰素通路，形成反馈环路。
2. **不同单核细胞亚群具有独特的CLR表达谱**：通过对小鼠骨髓来源单核细胞的scRNA-seq分析发现，LPS刺激几乎上调了所有检测到的CLR基因（包括Mincle/Clec4e, Clec4a1, Clec4a3等）的表达，且在不同细胞亚群中表达异质性明显。4-苯基丁酸盐（PBA）可抑制LPS诱导的CLR上调。
3. **小胶质细胞也上调CLR**：分析LPS注射后小鼠脑小胶质细胞的_bulk RNA-seq_数据发现，除了Mincle，Clec4a1, Clec4a3和Clec4a2等CLR也被大幅上调，表明髓系细胞响应LPS/TLR4具有广泛的CLR上调特征。
4. **Mincle-KO小鼠免受急性肝脏炎症但脂肪炎症加重**：在低剂量LPS诱导的急性炎症模型中，WT小鼠肝脏出现炎症和免疫细胞浸润，而Mincle-KO小鼠肝脏炎症受到保护。然而，Mincle-KO小鼠的脂肪组织炎症显著加重，提示炎症部位从肝脏转移至脂肪组织。性别差异分析显示，雄性小鼠无论基因型均出现脂肪炎症，而雌性仅Mincle-KO小鼠出现加重炎症。
5. **LPS诱导CLR基因发生可变剪接**：_Bulk RNA-seq_分析显示，LPS刺激后，肝脏中Mincle转录本主要包含内含子保留的非编码异构体，而Dectin-2和Dectin-3则上调了可编码功能蛋白的正确异构体。WGCNA分析表明，CLR基因模块与LPS挑战和Mincle基因型密切相关。
6. **NK基因受体复合物在肝脏疾病中失调**：分析AH患者肝脏数据发现，NK基因受体复合物中的绝大多数CLR基因在AH中发生差异表达，重症AH患者中Mincle, Dectin-3, DCIR等显著上调，提示先天免疫细胞 influx 及CLR在AH发病中的重要作用。

**讨论与结论**
研究人员总结认为，继发性免疫监视是先天免疫系统在初级威胁（如肠道渗漏）后快速多样化检测能力的机制。Mincle及其他CLR受TLR信号通过NF-κB通路广泛调控，这一过程在人类和小鼠中高度保守。Mincle在肝脏急性炎症中起关键保护作用，其缺失会导致炎症向脂肪组织转移，揭示了组织间炎症平衡的重要性。此外，CLR基因的可变剪接调控及在AH患者肝脏中的广泛上调，为理解肝脏免疫病理提供了新视角。论文最终结论指出，CLR在响应感染因子及组织特异性炎症中发挥重要作用，上调的CLR可作为治疗严重AH以减少炎症的潜在靶点，深入理解其调控机制和功能有助于开发新型疗法。