Niosome(诺osome/类脂囊泡)包封东革阿里(Eurycoma longifolia)标准化水提物用于体外潜在免疫调节活性的开发

《Journal of Nanotechnology》：Development of Niosome-Encapsulated Standardized Water Extract of Eurycoma longifolia for Potential Immunomodulatory Activity In Vitro

　　

摘要：Eurycoma longifolia（东革阿里）是一种著名的药用植物，以其抗癌活性和免疫调节(immunomodulatory)特性而闻名。尽管具有治疗潜力，但该提取物表现出低生物利用度，尤其在啮齿动物研究中归因于eurycomanone（宽叶苦木酮/去氢苦木酮）透膜性有限。本研究旨在开发含东革阿里标准化水提物的niosome（非离子表面活性剂囊泡）制剂并评估其免疫调节活性。采用加热法制备三种含不同稳定剂的东革阿里提取物niosome制剂，按稳定剂缩写为：Nio1含十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)；Nio2含α-生育酚(α-tocopherol)；Nio3含phenonip（尼泊金复合防腐剂）。对所制niosome进行粒径(particle size)、多分散指数(polydispersity index, PDI)、ζ电位(zeta potential)、pH、稳定性、包封率(entrapment efficiency, EE)及体外药物释放(in vitro drug release)等理化表征。所有niosome制剂均具理想粒径(195–493 nm)、低PDI值(0.05–0.13)、负ζ电位(?30.63至?44.90 mV)及pH 7.05–7.55，室温下3个月贮存期内物理稳定，EE为59.50%–66.90%。在pH 1.2、6.8和7.4下的体外药物释放符合扩散控释机制。通过脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导小鼠巨噬细胞(RAW264.7)细胞系评估niosome的体外细胞活力及免疫调节作用。细胞毒性数据显示Nio2对Vero、THP-1及RAW 264.7细胞的毒性较低，IC50分别为19.90、22.78和23.87 μg/mL。免疫调节实验表明Nio2处理显著抑制LPS刺激小鼠巨噬细胞的一氧化氮(nitric oxide, NO)释放，并能增强THP-1细胞对大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)的吞噬能力，效果与未包封的东革阿里水提物相当。结果表明Nio2可作为有效纳米载体，通过激活THP-1细胞增强免疫调节活性并对巨噬细胞产生潜在益处。综上，本研究成功开发了包载东革阿里标准化水提物的niosome制剂，具潜在免疫调节活性，支持进一步开展体内免疫调节研究。

论文解读：Niosome包封东革阿里(Eurycoma longifolia)标准化水提物用于体外潜在免疫调节活性的开发

研究背景与意义

病毒性传染病因新病原体的持续出现构成全球健康威胁，登革热等严重病毒感染的病理损伤很大程度上归因于宿主免疫系统失调引发的细胞因子风暴(cytokine storm)，即过量释放IL-6、TNF-α、NO等促炎介质。因此调控过度免疫反应是缓解重症病毒相关免疫病理的关键治疗靶点，免疫调节疗法日益受到关注。Eurycoma longifolia（东革阿里/Tongkat Ali）是东南亚传统药用灌木，含苦木素(quassinoids)、生物碱（如canthin-6-one、β-carbolines）、酚类等成分，其中eurycomanone常被用作化学标志物，具抗炎、抗肿瘤等药理活性，可通过抑制NF-κB通路降低iNOS、IL-6表达发挥免疫调节作用。然而东革阿里标准化水提物在啮齿动物实验中显示生物利用度低，主要因eurycomanone透膜性差限制了其作为免疫调节剂的疗效。为克服此缺陷，研究人员选用niosome（非离子表面活性剂囊泡，由非离子表面活性剂与胆固醇构成，可在亲水内核包封水溶性活性成分，具备改善溶解度、稳定性、生物相容性及控释等优势）作为纳米递送系统包封东革阿里标准化水提物。目前尚无niosome包封东革阿里用于免疫调节用途的研究报道。本研究由Mohammad Nor Farhan Saat等发表于《Journal of Nanotechnology》，旨在制备并表征三种不同稳定剂配方的东革阿里水提物负载niosome，评估其理化性质、稳定性、体外释放及在LPS诱导巨噬细胞模型中的细胞毒性和免疫调节活性，验证niosome能否在保持提取物生物活性的同时提供稳定的递送平台，为后续体内研究奠定基础。

主要关键技术方法

研究人员购得eurycomanone标准化为0.8%–1.5%（w/w）的东革阿里根水提物（Biotropics, Malaysia），以Tween 60与Span 60（摩尔比2:1）为非离子表面活性剂、胆固醇为膜稳定剂，分别以SDS、α-tocopherol、Phenonip为稳定剂制备三种niosome配方（Nio1/Nio2/Nio3），采用加热-超声法成囊。通过动态光散射(dynamic light scattering, DLS)测粒径、PDI及ζ电位，透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)观察形态，pH计测酸碱度，离心及90天室温贮存评估物理稳定性；超速离心分离游离/包封药物，UV-vis于λ_max=250 nm测吸光度计算包封率(EE)；采用透析袋扩散法在模拟胃液(pH 1.2)、十二指肠液(pH 6.8)及回肠液(pH 7.4)中做体外释放并拟合零级、一级、Higuchi、Hixson-Crowell及Korsmeyer–Peppas释放动力学模型。细胞实验使用非洲绿猴肾细胞(Vero)、人单核细胞(THP-1)及小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)（均购自ATCC），以CellTiter-Glo发光法测ATP评估细胞毒性并计算IC₅₀；LPS诱导RAW264.7炎症模型，Griess试剂法测上清NO/亚硝酸盐(nitrite)浓度评价NO抑制率；THP-1经PMA分化后以IgG-FITC标记乳胶微球吞噬实验评估吞噬活性，以未处理组及姜黄素(curcumin)阳性对照作参照，数据以均值±标准差表示，单因素方差分析(one-way ANOVA)及Tukey事后检验判定显著性(p<0.05)。

研究结果

3.1. Characterization of Eurycomanone and E. longifolia Extract–Loaded Niosome Formulation（宽叶苦木酮及东革阿里提取物负载Niosome制剂的特征分析）

Eurycomanone具亲水性（log D = ?0.35）、在不同生理pH下化学稳定，适合被niosome亲水内核包封。三种配方分别引入SDS（增加表面电荷、静电排斥防聚集）、α-tocopherol（提高EE及抗氧化保护）、Phenonip（防腐抑菌维持贮存稳定），通过系统比较评估不同稳定剂对niosome理化性能的影响。

3.2. Physicochemical Characterization（理化表征）

3.2.1. Particle Size, PDI, and Zeta Potential（粒径、多分散指数与ζ电位）：三配方均呈均匀乳白色分散体无分层。Nio1粒径最小(193.57±4.35 nm)，Nio2为221.03±0.99 nm，Nio3最大(493.16±8.60 nm)。PDI分别为0.11、0.05、0.13（均<0.4，属单分散稳定体系）。ζ电位均为负值，Nio2最负(?44.90±0.10 mV)，Nio1为?38.43±1.40 mV，Nio3为?30.63±0.37 mV，表明粒子间静电排斥可抵抗聚集融合。90天贮存后粒径略增（Nio1: 290.33 nm；Nio2: 296.93 nm；Nio3: 539.13 nm），PDI轻微上升但仍处可接受范围，无相分离或变色，物理稳定。

3.2.2. Morphology（形态学）：TEM显示niosome为球形单层大囊泡(unilamellar vesicles)，未见聚集，与DLS粒径趋势相符，囊内纹理对应包封的水提物。

3.2.3. pH Analysis（pH分析）：初始pH Nio1=7.55、Nio2=7.35、Nio3=7.05，90天内无显著变化(p>0.05)，近中性适宜口服给药，非离子表面活性剂与胆固醇构成的双层在酸性环境中亦能维持结构完整性。

3.2.4. Stability Analysis（稳定性分析）：4000 rpm离心15 min无分层或沉淀；室温90天贮存外观、颜色不变，证实配方具良好短期及中期物理稳定性，α-tocopherol增强双分子层刚性及抗氧化性有助于Nio2的稳定表现。

3.3. EE（包封率）

Nio3 EE最高(66.90±6.62%)，Nio2次之(65.93±2.99%)，Nio1最低(59.50±0.91%)，三组间差异无统计学意义(p>0.05)，表明所选稳定剂未造成包封率的显著差异。

3.4. In Vitro Drug Release Analysis（体外药物释放分析）

24 h累积释放：pH 1.2时Nio1(68.10%)>Nio3(57.68%)>Nio2(48.80%)；pH 6.8时Nio1(60.70%)>Nio3≈57.68%>Nio2(49.60%)；pH 7.4时Nio1(77.37%)>Nio3(73.25%)>Nio2(55.66%)，组间差异无统计学意义(p>0.05)。三种pH下释放曲线最佳拟合模型均为Higuchi模型（R²接近或超0.98），表明eurycomanone从niosome中以扩散控释(diffusion-controlled release)机制释放，且释放行为受环境pH影响小，具备pH非依赖性缓释特征。

3.5. Cytotoxicity Analysis of Niosome Formulations（Niosome制剂的细胞毒性分析）

在东革阿里水提物本身IC₅₀>62.5 μg/mL（低细胞毒）背景下，Nio2对Vero、THP-1、RAW264.7的IC₅₀分别为19.90、23.87、22.78 μg/mL，显著高于Nio1（~4.99、4.81、21.32 μg/mL）和Nio3（~5.59、5.64、18.64 μg/mL），说明Nio2细胞毒性最低、安全窗较宽，后续免疫实验选用低于其IC₅₀的浓度(12.5 μg/mL)以保证活性同时避免细胞死亡干扰。

3.6. Anti-Inflammatory Activity (NO Inhibition)（抗炎活性—一氧化氮抑制）

LPS诱导RAW264.7产生大量NO，Nio2(12.5 μg/mL)与未包封东革阿里水提物分别抑制NO生成47.86%和35.33%，与阳性对照curcumin(61.36%)相当，且Nio2抑制率显著高于未包封提取物(p<0.05)。说明niosome包封未损害提取物的抗炎/抗炎症活性，且略微提升NO抑制效果，能维持提取物生物活性并提供可控细胞暴露。

3.7. Phagocytic Activity（吞噬活性）

THP-1细胞经Nio2、东革阿里水提物及curcumin处理后，吞噬荧光微球比例分别为4.08%、4.38%、4.47%，均显著高于未处理组(2.77%)(p<0.05)。表明Nio2可像原提取物一样激活巨噬细胞/单核细胞的吞噬功能，保留东革阿里的免疫增强（免疫调节）作用，未引起不良免疫过激或抑制。

讨论与结论总结

本研究成功制备了负载东革阿里标准化水提物的niosome纳米载体(Nio1/Nio2/Nio3)，其中含α-tocopherol的Nio2配方具适宜纳米粒径(～221 nm)、最低PDI(0.05)、最负ζ电位(?44.90 mV)、较高EE(65.93%)、pH非依赖扩散控释特征及最低细胞毒性(IC₅₀约20–24 μg/mL)，室温90天物理稳定。体外细胞实验证明Nio2在低于其IC₅₀浓度下既显著抑制LPS诱导巨噬细胞的过量NO产生（抗炎/免疫调节），又增强THP-1源巨噬细胞对E. coli的吞噬能力（免疫激活），生物效应与原水提物相当甚至略优，表明niosome包封未破坏东革阿里中quassinoids、生物碱等免疫活性物质，且niosome作为生物相容性递送平台可提供配方稳定性与控释优势，有望克服原提取物口服生物利用度低的局限。结论原文翻译如下：

本研究成功开发了含东革阿里(Eurycoma longifolia)标准化水提物的稳定niosome（非离子表面活性剂囊泡）制剂。优化后的配方表现出理想的理化性质、良好的贮存稳定性、高包封率(EE)及受控的pH非依赖性释放行为。生物学评价显示niosome制剂保留了提取物的免疫调节及抗炎活性，表现为对LPS诱导NO生成的抑制及对巨噬细胞吞噬功能的增强。值得注意的是，所观察到的免疫调节与抗炎效应与东革阿里水提物本身相当，表明niosome制剂并未削弱E. longifolia提取物中植物化学成分的生物活性。这些结果支持niosome作为一种生物相容性递送平台的作用——在保持生物效力的同时提供更佳的制剂稳定性与可控的细胞暴露。这些特性对于克服已报道的E. longifolia生物活性成分低生物利用度问题尤为相关。因此，所开发的niosome制剂代表了一种有前景的递送策略，值得进一步开展体内研究以确认其在增强治疗效果方面的潜力。