《npj Biological Physics and Mechanics》：Polarization increases nuclear stiffness in macrophages despite reduction in lamin A/C levels
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摘要：巨噬细胞是可贡献于组织稳态及多种病理过程的固有免疫细胞。其微环境信号可诱导巨噬细胞适应不同功能表型，即极化（polarization）。由于既往研究表明巨噬细胞在促炎性极化（pro-inflammatory polarization）时会降解核被膜蛋白l
摘要：巨噬细胞是可贡献于组织稳态及多种病理过程的固有免疫细胞。其微环境信号可诱导巨噬细胞适应不同功能表型，即极化（polarization）。由于既往研究表明巨噬细胞在促炎性极化（pro-inflammatory polarization）时会降解核被膜蛋白lamin A/C，而lamins被认为是决定核可变形性（nuclear deformability）的关键因子，研究人员旨在探明促炎性刺激对核力学（nuclear mechanics）的影响。研究人员意外发现：经极化的骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDM）虽lamin A/C水平降低，但其细胞核较未极化巨噬细胞的核更难变形（即变形能力更低）。此外，促炎性巨噬细胞较未极化巨噬细胞表现出改变的染色质动力学（chromatin dynamics），包括其三甲基化组蛋白H3第9位赖氨酸（trimethylated histone H3K9, H3K9me3）从核周边重新分布至核内部，以及染色质压缩（chromatin compaction）增强。研究结果表明，促炎性刺激诱导巨噬细胞发生染色质改变并驱动核硬化（nuclear stiffening）；在此类细胞中，染色质而非核纤层（nuclear lamina）是抵抗核变形的主要驱动力。这些发现可能具有生理学相关性：核的机械特性可影响极化巨噬细胞在受限间隙迁移或参与炎症疾病病理过程中对环境适应与应答的能力。
论文解读：《Polarization increases nuclear stiffness in macrophages despite reduction in lamin A/C levels》
研究背景与立项依据
细胞核的机械特性决定了其在细胞骨架及胞外力作用下的抗变形能力，对细胞穿过狭窄间隙（interstitial spaces，直径1–3 μm）的迁移、机械感受（mechanotransduction）及基因表达调控均具有重要意义。在多数细胞类型中，核抗大形变的能力主要由核纤层（nuclear lamina，主要由A型lamins即lamin A/C及B型lamins即lamin B1/B2构成的中间丝网状结构）决定，lamin A/C表达量通常与核刚度（nuclear stiffness）正相关。然而，免疫细胞的核力学研究相对匮乏。已有报道显示，小鼠骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDM）在促炎性极化（即M1样极化，由脂多糖LPS+干扰素-γ IFNγ诱导）时lamin A/C快速降解，且阻断lamin A/C丢失会减弱促炎反应；但lamin A/C下调对巨噬细胞核力学的具体影响尚不清楚。此外，既往相关核力学测量存在极化时间短（≤6 h）及通量低（<10个细胞）的局限。鉴于巨噬细胞本身lamin A/C基础水平远低于小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts, MEFs）等其他细胞类型，研究人员假设并验证：在巨噬细胞极化过程中，染色质状态变化可超越lamin A/C减少带来的软化效应，主导核力学重塑。本文发表于《npj Biological Physics and Mechanics》。
主要关键技术方法
研究人员从C57BL/6小鼠股骨与胫骨分离骨髓祖细胞，经巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化为BMDM，分别维持为未极化（M0）或用LPS+IFNγ极化24 h为M1样巨噬细胞。关键技术包括：（1）微流控微管吸吮实验（microfluidic micropipette aspiration assay）测定完整细胞大形变下核突出长度以量化核可变形性，并行细胞松弛素D（cytochalasin D）处理解除肌动蛋白 cytoskeleton干扰；（2）布里渊显微术（Brillouin microscopy）无标记活细胞测核内布里渊频移（Brillouin frequency shift, BFS）反映核刚度；（3）荧光寿命成像显微术（fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）用Hoechst 33342染色测平均荧光寿命以反映染色质压缩程度；（4）活细胞核染色质斑点单粒子追踪（single particle tracking）结合系综时间平均均方位移（ensemble-time-averaged mean squared displacement, MSD）及广义斯托克斯-爱因斯坦关系（generalized Stokes-Einstein relation）估算染色质储存模量G'与损耗模量G"；（5）Transwell迁移实验检测不同孔径（3 μm、5 μm、8 μm）下细胞穿越能力；（6）免疫荧光、蛋白质免疫印迹（immunoblotting）及流式细胞术分别用于lamins、异染色质标志H3K9me3与H3K27me3定位与定量、细胞周期DNA含量分析，三维共聚焦成像分析核体积形态。
研究结果
Pro-inflammatory macrophages have decreased Lamin levels and altered nuclear morphology（促炎性巨噬细胞lamin水平下降且核形态改变）
Western blot与免疫荧光证实M1巨噬细胞lamin A/C显著低于M0，lamin B1略降但不显著，核被膜蛋白emerin不变，lamin B受体（lamin B receptor, LBR）轻微但显著降低。M1细胞核体积、面积、高度、圆度均较M0减小；核周皱褶（circumferential wrinkling）比例及多余周长（excess perimeter）增加，但核内陷（invaginations）与核隧道（tunnels）比例无差异。细胞周期分析示M1更多处于G0/G1期，S期减少，总DNA含量无差异，提示核体积缩小伴DNA密度升高即染色质压缩。DAPI染色大尺度染色质团块（chromocenters）数目、面积与分布在M0与M1间无显著差异。
Pro-inflammatory polarization leads to decreased nuclear deformability in macrophages（促炎性极化导致巨噬细胞核可变形性降低）
微管吸吮结果显示，M1巨噬细胞在极化6 h核突出长度有降低趋势（p=0.101），24 h时显著短于M0，即M1核可变形性降低、核刚度升高，与"lamin A/C降低应致核变软"的预期相反。用cytochalasin D破坏肌动蛋白聚合后，M0与M1核可变形性均上升，但M1仍显著低于M0且完全通过微通道的细胞比例更少，表明核硬化源于核本征属性而非胞质肌动蛋白 cytoskeleton差异。布里渊显微术也显示M1核BFS高于M0，佐证核内部刚度增加。
Pro-inflammatory macrophages have altered H3K9me3 localization, increased chromatin compaction, and altered chromatin dynamics（促炎性巨噬细胞H3K9me3定位改变、染色质压缩增强及染色质动力学改变）
免疫荧光线强度分析显示M1核周边H3K9me3信号减弱，外周/核质强度比下降，而兼性异染色质标志H3K27me3无变化。FLIM示M1核Hoechst荧光寿命显著低于M0，提示染色质压缩增强。活细胞染色质斑点追踪得M1核弹性储存模量G'高于M0，损耗模量G"无差异；MSD降低且局部异常扩散指数α（anomalous exponent α）低于M0，说明染色质运动受限、核内更刚硬，符合染色质压缩及拥挤度增加所致硬化模型。
M1 macrophages exhibit reduced transwell migration in both confined and un-confined environments（M1巨噬细胞在受限与非受限Transwell中迁移均降低）
24 h时M1穿过3 μm、5 μm、8 μm孔径Transwell膜的细胞数均少于M0（加或不加趋化因子fMLP结果一致），提示除核可变形性下降外，M1整体迁移能力降低可能与增强的黏附、细胞间聚集及细胞骨架重编程有关，但核硬化是受限环境中迁移受限的贡献因素之一。
讨论与结论翻译
本研究全面表征了小鼠促炎性巨噬细胞的核力学，发现尽管促炎性巨噬细胞lamin A/C蛋白水平降低，其核可变形性反而下降（即核刚度增加），这与多数其他细胞类型中lamin A/C降低对应核变软的报道相反。M1核刚度增加不因肌动蛋白 cytoskeleton差异引起——用cytochalasin D处理后M1核仍比M0硬。原代促炎性巨噬细胞中，除lamins与actin外其他因素主导核力学。M1核体积缩小、核被膜皱褶增加而总DNA量相当，提示炎症信号驱动核收缩与染色质压缩。核内陷/隧道比例与M1核硬化无直接关联。FLIM示M1染色质寿命缩短，与染色质凝聚一致并可解释核刚度升高；布里渊显微术确认核内部刚度增加；活细胞染色质示踪也指示核刚度升高；H3K9me3从核周边重分布至核内部。综合看，核体积缩小、染色质压缩与异染色质重组足以在lamin A/C下调背景下使促炎性巨噬细胞核硬化。巨噬细胞本底lamin A/C远低于其他细胞类型（含4T1乳腺癌细胞），因此促炎极化进一步降低lamin A/C不太可能再软化核，而极化时核体积缩小引起的染色质压缩与拥挤才是M1样巨噬细胞核刚度增加的主要驱动因素。这些发现拓展了巨噬细胞核生物学的认知，表明在此类细胞中，促炎性极化相关的染色质压缩足以增大核对大形变的力学抵抗，不依赖于lamin A/C水平降低。本研究将推动对免疫细胞核力学生物学的深入探究及对不同染色质组织或lamin水平细胞之核力学特征的进一步表征。
