选择性作用于成年肌肉尼古丁乙酰胆碱受体的正向别构调节剂

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Positive allosteric modulator selective for adult muscle nicotinic acetylcholine receptor

　　

肌肉尼古丁乙酰胆碱受体（AChR）是神经肌肉信号传递的关键介质，对于人体所有随意运动至关重要。在本研究中，研究人员介绍了DC-98-LC74，一种针对成年骨骼肌型AChR的正向别构调节剂（PAM）。通过使用Ca²⁺荧光成像板读取器（FLIPR） assays，研究人员证明其对成年骨骼肌AChR具有选择性，优于神经元亚型。来自离体小鼠膈肌制剂的神经生理学记录显示，DC-98-LC74延长了野生型（WT）成年（而非含有胎儿通道的膈肌）的终板电流。对成年和胎儿受体的嵌合通道以及在饱和浓度胆碱下的单通道研究表明，该PAM不与任何正构位点结合，而是通过涉及ε M2-M3环的机制增加非配体结合开放概率。研究人员还显示，DC-98-LC74将多种快通道突变AChR的爆发持续时间提高到WT水平，表明正向别构调节可能成为这种难以治疗的先天性肌无力综合征（CMS）亚型的治疗策略。关于老年性肌萎缩小鼠的初步数据也表明，肌肉型AChR的正向别构调节不仅在肌无力中具有潜在益处，而且在涉及神经肌肉接头（NMJ）的其他神经肌肉疾病中也具有潜力。

**论文解读：选择性成年肌肉AChR正向别构调节剂的发现与功能表征**

**研究背景与问题**

神经肌肉接头（NMJ）是运动神经末梢与骨骼肌纤维之间的突触连接，其功能核心在于肌肉尼古丁乙酰胆碱受体（AChR）介导的神经信号传递。AChR是一种五聚体配体门控离子通道（pLGIC），其动力学特性和突触后精确定位是骨骼肌收缩的基础。AChR功能受损可由编码基因突变（导致先天性肌无力综合征，CMS）或自身抗体攻击（导致重症肌无力，MG）引起，同时也是肌萎缩侧索硬化症（ALS）、脊髓性肌萎缩症（SMA）及老年性肌萎缩等多种神经肌肉疾病的病理环节。因此，改善AChR功能的药物具有广泛治疗潜力。

既往对AChR药理学干预多集中于正构位点激动剂或拮抗剂，但这类药物受限于天然配体的存在，易产生时空非特异性效应。正向别构调节剂（PAM）通过结合别构位点增强受体活性，仅在天然配体存在时发挥效应，具有更高特异性和耐受性。已有PAM（如苯二氮?类）成功用于其他pLGIC的临床治疗，但针对肌肉型AChR的PAM发展缓慢。Saito等（2020）首次报道了肌肉型AChR的PAM，并在大鼠MG模型中证实其可增强肌力，但未提供选择性或机制数据。本研究旨在发现一种选择性作用于成年肌肉AChR的PAM，并在分子、细胞和离体组织水平全面表征其作用机制与治疗潜力。

**研究内容、结论与意义**

研究人员通过对诺华化合物库（180万种结构多样化化合物）进行无偏倚高通量筛选，利用Ca²⁺FLIPR assay识别出候选化合物DC-98-LC74（简称DC-98）。该化合物在亚最大浓度正构激动剂存在下显著增强成年肌肉型AChR活性，且不依赖于正构位点结合。通过单通道电生理、嵌合受体构建、离体小鼠膈肌电生理以及老年性肌萎缩小鼠神经-肌肉制备等功能实验，研究人员系统表征了DC-98的选择性、作用机制及治疗效果。研究表明，DC-98通过结合ε亚基M2-M3环区域，增加受体非配体结合开放概率（L0），从而延长成年野生型及快通道CMS突变AChR的爆发持续时间，恢复其至野生型水平。在离体老年性肌萎缩小鼠肌肉中，DC-98可逆转疲劳相关的肌肉抽搐幅度下降，并显著延长抽搐时程。该研究首次报道了选择性成年肌肉AChR的PAM及其详细机制，为CMS尤其是难治性快通道亚型以及涉及NMJ功能障碍的疾病（如老年性肌萎缩）提供了新的治疗策略。论文发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences》。

**关键技术方法（250字内）**

研究人员采用高通量筛选（Novartis化合物库，180万化合物）结合Ca²⁺FLIPR assay（HEK293细胞表达人成年肌肉AChR）；通过单通道记录（细胞贴附式）分析爆发持续时间和簇开放概率；以离体小鼠膈肌制剂记录微型终板电流（mEPC）和终板电位（EPP）；采用神经-肌肉制备（成年和27-30月龄老年性肌萎缩C57BL/6JRj小鼠）测量等长肌力；通过ε/γ亚基嵌合受体构建（交换N端胞外域、M2-M3环、M3-M4胞内环）鉴定关键结构域。

**研究结果（保留小标题）**

**识别AChR PAM DC-98：** 通过高通量筛选（Ca²⁺FLIPR assay），从180万化合物中鉴定出DC-98。在CN21-CHRNG敲除细胞（稳定表达人成年肌肉AChR的横纹肌肉瘤细胞系）中，10 μM DC-98使ACh刺激的最大荧光效应显著增加至145.6%，且无拮抗作用。

**DC-98对不同类型AChR的选择性：** Ca²⁺FLIPR assay显示，10 μM DC-98对成年肌肉型（α1β1δε）AChR的增强效应（280%）显著高于神经元亚型α7（147%）、α4β2（109%），对α3β4表现为抑制（IC₅₀≈13.45 μM）。在无正构激动剂时，DC-98无激动活性。

**DC-98延长成年野生型和快通道AChR的爆发持续时间：** 单通道记录显示，30 μM DC-98使成年WT AChR最长爆发时间常数（τ3）从5.02 ms增至30.0 ms；对快通道突变体εP141L和βI308S，τ3分别从0.81 ms和0.84 ms延长至6.34 ms和7.50 ms；但对胎儿型（含γ亚基）AChR无显著影响。

**DC-98增加簇化AChR活性的开放概率：** 在10 μM ACh（WT）或300 μM ACh（εP141L）诱导的簇活动中，DC-98以浓度依赖方式增加簇内开放概率。对WT，100 μM DC-98使开放概率从0.31升至0.87；对εP141L，从0.05升至0.61。EC₅₀分别为7.8 μM和78.9 μM，提示突变位点可能降低化合物效力。

**DC-98可在正构位点饱和时增加AChR簇开放概率：** 在10 mM胆碱（饱和浓度）下，30 μM DC-98仍使WT AChR簇开放概率从0.03增至0.12，且出现长开放事件（τ=4.34 ms），表明DC-98并非通过改变正构位点亲和力，而是直接增加非配体结合开放概率。

**DC-98延长成年小鼠膈肌终板电流，但对依赖胎儿AChR的AChR缺乏模型无效：** 离体膈肌两电极电压钳记录显示，30 μM DC-98使成年WT小鼠mEPC衰减时间常数从1.19 ms增至2.15 ms；而在Chrne基因敲除（仅表达胎儿AChR）模型中，mEPC无显著变化。此外，DC-98还引起输入电阻增加等脱靶效应。

**DC-98对嵌合AChR的作用：** 通过ε/γ亚基嵌合体单通道记录，发现将ε亚基M2-M3环替换为γ序列后，DC-98的爆发持续时间延长效应消失（τ3从24.6 ms降至10.9 ms，与DMSO对照无差异），而置换N端胞外域或M3-M4胞内环则不影响DC-98活性，表明ε M2-M3环对DC-98作用至关重要。

**DC-98改善离体老年性肌萎缩小鼠神经诱导的肌力：** 在成年和老年性肌萎缩小鼠的神经-伸趾长肌（EDL）制备中，DC-98（30 μM）完全逆转疲劳诱导的抽搐幅度下降（老年组），使抽搐曲线下面积（AUC）增加180%（老年）和160%（成年）。神经刺激模式下，DC-98剂量依赖性地将老年组肌肉抽搐幅度提高最多28%，AUC增加最多1406%（30 μM）。

**总结与讨论**

本研究报道了选择性成年肌肉AChR的PAM——DC-98。单通道数据表明，DC-98通过作用于ε亚基M2-M3环，增加受体非配体结合开放概率（L₀），而非与正构位点结合。该化合物可恢复两种位于不同亚基（β和ε）的快通道CMS突变AChR的爆发持续时间至WT水平，提示正向别构调节可为难治性CMS亚型提供新疗法。在老年性肌萎缩小鼠离体肌肉中，DC-98改善神经诱导的肌力，表明其除肌无力外还可能用于其他涉及NMJ功能障碍的疾病。然而，DC-98也表现出脱靶效应（如增加mEPP频率、输入电阻变化及部分纤维的异常ACh释放），需进一步优化其效力和特异性。未来需开发更高效、特异的PAM，并在体内模型中验证其对多种神经肌肉疾病的持续疗效。

**研究结论（翻译自Final Summary）**

DC-98是一种选择性作用于成年肌肉型AChR的PAM。数据表明，它增加受体的静息开放概率，而不结合正构位点，但可能通过M2-M3环起作用。它增加了两个不同亚基中两种快通道变体的开放时间，表明正向别构调节可能成为这些难以治疗的CMS亚型的治疗方法。它还对老年性肌萎缩小鼠的离体肌肉的抽搐力有积极影响。然而，DC-98也对NMJ活动产生了一些意想不到的效果，意味着在体内使用之前需要对分子进行进一步开发。