通过光亲和标记介导的定向和共价抗体固定技术，制备了一种稳健且超灵敏的表面增强拉曼散射（SERS）平台，用于黄曲霉素B1的生物传感

《Biosensors and Bioelectronics》：Fabrication of a Robust and Ultra-Sensitive SERS Platform via photoaffinity labeling-mediated Oriented and Covalent Antibody Immobilization for Aflatoxin B1 Biosensing

　　

张丽霞|张玉敏|潘子彤|鞠佳怡|杨洪明|唐金宝

中国山东省潍坊市山东第二医科大学药学院，261053

摘要

为了解决对黄曲霉毒素B₁（AFB₁）进行稳健且超灵敏检测的迫切需求，我们开发了一种表面增强拉曼散射（SERS）免疫传感器，该传感器具有精确、共价且定向均匀的生物界面。这是通过基因工程光亲和标记策略实现的。具体来说，利用一种经过工程改造的Fc结合蛋白——该蛋白包含一种光反应性非天然氨基酸和一个末端半胱氨酸标签——在温和的紫外线照射下对抗体Fc区域进行位点特异性标记。随后，这种经过巯基修饰的抗体通过牢固的Au–S自组装定向锚定在金纳米颗粒基底上，确保了最佳的“Fab-up”构型。基于这种高效架构，构建了一种间接竞争性SERS免疫测定方法。该平台表现出0.2 pg mL^-1-1

引言

黄曲霉毒素B₁（AFB₁）是由黄曲霉和寄生曲霉产生的一种高毒性和致癌性的次级代谢物，对全球食品安全构成了严重威胁（Shabeer等人，2022年；Yi等人，2024年）。由于其强烈的肝毒性和致畸性，AFB₁被国际癌症研究机构（IARC）列为I类人类致癌物。为了降低其在食品供应链中的风险，已经制定了严格的最大残留限量（例如，在欧盟为2-12 μg/kg）（Van de Perre等人，2015年）。这些担忧推动了开发既能高灵敏度又能高选择性地检测AFB₁的传感平台的努力。

目前AFB₁的检测主要依赖于色谱-质谱技术（LC-MS/MS）和免疫测定方法。尽管像液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）这样的方法具有出色的准确性和灵敏度，但其高昂的成本和复杂的样品制备过程限制了其在现场快速筛查中的应用（Capriotti等人，2014年）。免疫测定方法，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）（Lai等人，2017年）和侧向流动免疫测定（LFIA），操作较为简单，但通常缺乏痕量检测所需的灵敏度，而传统的LFIA很少具有定量能力（Hu等人，2014年；Raeisossadati等人，2016年）。除此之外，还开发了多种新兴的生物传感平台——包括电化学（Zhang等人，2025年）、荧光（Yan等人，2022年）和比色传感器（Wu等人，2023年）——以提高分析性能。然而，正如众多研究指出的那样，这些传感方法的一个共同关键瓶颈是生物识别界面的质量和稳定性不佳。这些“大型”生物传感器的分析性能从根本上取决于抗体的固定质量，其中随机取向和非共价连接往往导致灵敏度降低和界面稳定性差（Du等人，2025年；Konrad等人，2011年）。因此，开发结合高灵敏度、良好选择性和操作简便性的新方法仍然是当务之急。

表面增强拉曼散射（SERS）作为一种有前景的生物传感技术，因其出色的灵敏度、分子指纹识别能力和抗光漂白能力而受到关注（Deriu和Fabris，2025年；Langer等人，2019年；Ma等人，2024年）。通过将抗体与支持局部表面等离子体共振的纳米结构结合，SERS免疫传感器可以实现痕量分析物的高选择性检测（Cao等人，2024年）。然而，性能不仅取决于基底的增强因子，还关键取决于生物识别界面的质量。抗体的固定方法——其取向、密度和构象完整性——直接决定了传感器的灵敏度和重复性（Chen等人，2023年；Ebbah等人，2024年）。

研究表明，对抗体的定向固定（完全暴露Fab区域）显著提高了抗原结合位点的可及性和活性，相比传统的随机化学偶联方法，从而提高了检测灵敏度（Lee等人，2021年；Xu等人，2024年）。常见的策略是利用葡萄球菌蛋白A（SpA）或链球菌蛋白G（SpG）对抗体Fc区域进行亲和吸附。然而，这些非共价相互作用可能导致抗体在复杂基质中或在重复使用后脱落，从而影响传感器的稳定性和寿命（Makaraviciute和Ramanaviciene，2013年）。因此，开发结合位点特异性、共价键合和精确取向控制的固定方法是推进SERS免疫传感器发展的关键。

最近，光亲和标记提供了一种可行的解决方案（Du等人，2025年；Park等人，2021年）。这种方法利用基因编码扩展，在工程改造的Fc结合蛋白（例如SpG的C3结构域）中位点特异性地引入光反应性非天然氨基酸（p-苯甲酰-L-苯丙氨酸，Bpa），并连接一个C末端半胱氨酸（Cys）标签。该蛋白首先通过其Fc结合域与抗体形成生物亲和复合物。在365 nm紫外线照射下，Bpa被激活并与抗体Fc区域形成不可逆的C-C共价键，从而将Cys标签锚定在抗体上（Chen等人，2020年）。最后，金-巯基（Au-S）自组装将抗体以Fab朝外的定向方式共价固定在裸金表面上（Du等人，2025年）。这种策略提供了位点特异性、共价稳定性和广泛的适用性，为构建高性能生物传感界面开辟了新的途径。

正如我们之前的研究（Du等人，2025年；Zhang等人，2025年）所证明的，这种方法利用非天然氨基酸和半胱氨酸标签实现了精确、共价且“Fab-up”的抗体固定。虽然在电化学平台上取得了成功，但将其应用于SERS则具有独特的挑战性，因为SERS的电磁增强效果会随着与等离子体基底的距离增加而呈指数衰减（Langer等人，2019年）。因此，这种基因工程界面提供的严格取向顺序、界面紧凑性和化学稳定性对于SERS来说至关重要。通过在强烈的纳米间隙“热点”内精确捕获目标，这种架构在分子水平上诱导了协同放大效应，有可能打破现有免疫测定的灵敏度瓶颈。

在这里，我们报道了一种专门用于复杂食品基质中痕量AFB₁检测的超灵敏SERS免疫传感器，该传感器通过Fc特异性光亲和共价偶联策略构建。如图1所示，首先使用氨基酰-tRNA合成酶/抑制tRNA技术（aaRS/tRNA）生成了含有光反应性IgG结合蛋白-Cys变体，并在其特定位置引入了Bpa。随后，通过生物亲和驱动的光交联，以位点特异性和共价方式制备了Cys修饰的抗体，然后通过金-巯基相互作用将其定向自组装到合理设计的SERS平台上。这种精确调控的生物界面随后被用于利用间接竞争性免疫检测SERS免疫测定法定量测定AFB₁。该传感器在面对真实花生油和大米样品时表现出出色的准确性、显著的稳定性和强大的抗干扰能力。这项工作不仅为快速AFB₁监测提供了一种非常可行的分析工具，还为下一代高性能SERS生物传感器的开发建立了一个通用的精密工程范例。

章节片段

材料与试剂

关键试剂包括三水合氯化金（HAuCl₄·3H₂O）、4-巯基苯甲酸（4-MBA）、非天然氨基酸Bpa以及特定的抗体/抗原均从商业渠道购买。详细的供应商信息和其他分析级化学品列在补充材料（SM）中。

仪器

SERS光谱是使用配备785 nm He-Ne激光器的HORIBA LabRam ARAMIS拉曼光谱仪获得的。形态学和光学表征使用标准TEM和SEM进行。

Cys修饰抗体的制备

在本研究中，构建了两种光反应性IgG结合蛋白-Cys变体，即17thZBpa-Cys和24thC3Bpa-Cys，用于制备Cys修饰的抗体（图S1）。结果表明，17thZBpa-Cys与小鼠抗AFB1 IgG（IgG2a）形成的结合物的光亲和标记产率为85%，24thC3Bpa-Cys与山羊抗BSA IgG形成的结合物的产率为91%（图S2A）。这些高结合效率

结论

CRediT作者贡献声明

唐金宝：撰写 – 审稿与编辑，项目管理。杨洪明：项目管理，资金获取。鞠佳怡：方法学，数据管理。张丽霞：撰写 – 初稿，正式分析。潘子彤：方法学，数据管理。张玉敏：撰写 – 审稿与编辑，方法学

Song等人，2021年。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（81971998）和山东省自然科学基金（编号ZR2022QB165）的支持。