《Frontiers in Aging Neuroscience》：H-ferritin nanoparticle-mediated antibody delivery across the blood-brain barrier
编辑推荐：
背景：治疗性单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）因其高选择性和强效性，在治疗神经系统疾病方面展现出巨大潜力。然而，其临床价值因难以有效穿透血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）而受到显著限制。已有研究表明，
背景：治疗性单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）因其高选择性和强效性，在治疗神经系统疾病方面展现出巨大潜力。然而，其临床价值因难以有效穿透血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）而受到显著限制。已有研究表明，靶向转铁蛋白受体1（transferrin receptor 1, TfR1）的抗体在外周给药后可进入脑内。此外，人H-铁蛋白（human H-ferritin, HFn）可通过TfR1介导的胞吞转运（transcytosis）自然地跨越血脑屏障，这使其成为脑靶向药物递送的一个极具吸引力的候选平台。本研究旨在评估利用HFn作为通用穿梭载体将治疗性抗体递送至脑内的可行性。方法：将抗BACE1单克隆抗体（1A11）化学偶联至HFn，并对所得纳米颗粒（1A11-HFn NPs）进行体外和体内评估，包括结构完整性、靶点结合、血脑屏障通透性、BACE1抑制活性及药效学效应。具体而言，HFn和mAb 1A11分别在大肠杆菌（Escherichia coli）和中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary, CHO cells）中表达并纯化。利用异双功能交联剂NHS-PEG-Mal将1A11偶联至HFn，随后分离纯化1A11-HFn NPs。通过生物层干涉技术（bio-layer interferometry, BLI）和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）验证其与人类BACE1（human BACE1, hBACE1）和人类TfR1（human TfR1, hTfR1）的双重结合能力。采用透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）进行结构表征。在表达人源化TfR1顶端结构域敲入（humanized apical domain TfR1 knock-in, hApiTfrc KI）的小鼠中，通过静脉（intravenous, IV）给药后测定血浆和脑组织中的药物浓度，以研究其药代动力学（pharmacokinetics, PK）和药效动力学（pharmacodynamics, PD）。结果：成功制备了1A11-HFn NPs，并证实其对hBACE1和hTfR1具有双重结合能力。TEM成像验证了纳米颗粒的结构完整性。体内研究显示，1A11-HFn NPs在给药后第1天和第3天脑内水平升高，但至第7天降至检测限（limit of detection, LOD）以下。第1天（而非第3天或第7天）到达脑内的剂量足以抑制BACE1活性，表明外周给药后药理有效剂量的抗体可被递送至脑内。结论：这些发现证明HFn可作为有效的穿梭载体，在药理学相关浓度下将mAbs递送穿越血脑屏障。该研究为HFn基纳米颗粒作为脑靶向生物治疗递送平台提供了基础性证据。
该论文于《Frontiers in Aging Neuroscience》发表，旨在解决治疗性单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）难以跨越血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）这一关键瓶颈问题。神经系统疾病（如阿尔茨海默病）患者众多，但至今仅约3%的治疗性抗体靶向中枢神经系统（central nervous system, CNS）疾病，主要原因在于BBB对生物大分子的阻碍作用。BBB由特化的脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells, BMECs）、紧密连接、星形胶质细胞等组成，是维持脑内稳态的重要屏障，但同时也极大限制了大分子药物进入脑实质。为克服这一障碍，研究人员积极探索内源性跨BBB转运途径，其中受体介导的胞吞转运（receptor-mediated transcytosis, RMT）被认为是最有希望的策略。TfR1在BMECs上高表达，是RMT途径中最受关注的靶点。H-铁蛋白（H-ferritin, HFn）作为天然铁储存蛋白，可通过TfR1介导的RMT跨越BBB，且其与TfR1的结合表位与内源性转铁蛋白不同，竞争效应较小。此外，HFn的24亚基笼状结构可实现与TfR1的多价结合，增强结合亲和力。基于此，研究人员拟探究HFn纳米颗粒（nanoparticles, NPs）作为通用穿梭载体递送治疗性抗体进入脑内的可行性，并以β-分泌酶1（β-secretase 1, BACE1）为模型靶点进行验证。
研究人员开展的此项研究具有重要的科学和临床意义。BACE1是淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）经β-分泌酶和γ-分泌酶顺序切割产生Aβ肽的关键限速酶，抑制BACE1活性可减少Aβ产生，是阿尔茨海默病治疗的潜在策略。然而，抗体类药物难以进入CNS限制了其疗效。该研究通过将抗BACE1单克隆抗体1A11与HFn偶联构建纳米递送系统，证实了HFn能够有效将抗体递送至脑内并产生药效学效应，为脑靶向生物治疗递送平台的开发提供了重要的基础性证据。
该研究主要应用了以下关键技术方法：重组蛋白表达与纯化技术（分别在大肠杆菌和CHO细胞中表达HFn和1A11）、化学偶联技术（利用NHS-PEG-Mal异双功能交联剂实现抗体与HFn的共价偶联）、动态光散射（dynamic light scattering, DLS）和透射电子显微镜（TEM）用于纳米颗粒结构表征、生物层干涉技术（BLI）和酶联免疫吸附测定（ELISA）用于结合活性验证，以及在hApiTfrc KI小鼠模型中进行的体内药代动力学/药效动力学（PK/PD）评估。
研究结果部分包含以下主要内容：
化学偶联与HFn及1A11-HFn纳米颗粒的表征：HFn纳米颗粒在大肠杆菌中表达并通过多步纯化方案获得，包括硫酸铵沉淀、Triton X-114去除内毒素以及两步尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）纯化。通过NHS-PEG-Mal（5 kDa）异双功能交联剂将具有人IgG1骨架的抗BACE1单克隆抗体1A11化学偶联至HFn表面。研究发现，偶联反应中蛋白浓度影响偶联效率：较低浓度（1 mg/mL）时偶联效率低于较高浓度（3-5 mg/mL）。SEC分析显示，提高蛋白浓度可增加目标偶联物（Peak 1）的产率，各峰经鉴定分别为：Peak 1为1A11-HFn，Peak 2为HFn，Peak 3为1A11，Peak 4为未反应的连接子。TEM结构分析证实化学修饰保持了HFn纳米颗粒特征性的中空球形纳米笼结构，部分纳米颗粒可见额外密度，推测来源于偶联的抗体。DLS测量显示，未偶联HFn和1A11的流体动力学直径分别约为14.5 nm和12.8 nm，而1A11-HFn纳米偶联物的流体动力学直径增至约50 nm，进一步证实复合物的成功形成。
1A11-HFn纳米颗粒的结合亲和力：通过BLI对纯化的1A11-HFn纳米颗粒进行体外靶受体结合评估。由于1A11-HFn制备物存在异质性（每个HFn纳米颗粒上偶联的1A11分子数不同），无法准确测定解离常数（dissociation constant, K
D），因此BLI仅用于确认制备物对其预期靶点的结合能力。结果显示，所有含HFn的构建体均仍能与hTfR结合，所有含mAb 1A11的构建体均仍能结合hBACE1。为排除信号来源于残留未偶联HFn的可能性，研究人员还通过ELISA设置特异性验证了1A11-HFn对hTfR的结合，该设置仅检测1A11-HFn而非未偶联的HFn。
1A11-HFn纳米颗粒的体内PK/PD profile：在hTfR1-KI小鼠中评估1A11-HFn纳米颗粒的药代动力学/药效动力学特征。纳米颗粒和对照组（未偶联HFn和未偶联1A11）以76.6 nmol/kg剂量经静脉注射给药，于1天、3天和7天采集样品（对照组仅第1天）。PK profile显示，1A11-HFn纳米颗粒在给药后24小时血浆浓度为100 nM，3天后浓度降低超过55倍，7天时降至定量下限（lower limit of quantification, LLOQ = 0.008 nM）以下。脑内检测显示，1A11-HFn纳米颗粒浓度约为未偶联1A11的40倍（分别约16 nM和0.4 nM），表明该构建体成功跨越BBB。与血浆相比，纳米颗粒从脑内的清除较慢（第3天较第1天降低2.5倍），第7时脑内不可检出（LLOQ = 0.04 nM）。药效方面，血浆中未偶联1A11和1A11-HFn纳米颗粒在第1天均显著降低Aβ
1-40水平，但此效应在第3天和第7天不显著。脑内，未偶联1A11在第1天未降低Aβ
1-40水平，而1A11-HFn处理在第1天较未偶联1A11降低Aβ
1-40水平，第3天和第7天则无显著效应，证实HFn可将抗体以药理学相关浓度递送至脑内。
讨论部分，研究人员首先阐述了生物制剂在中枢神经系统疾病治疗中的发展现状与困境。尽管生物制剂在近几十年革新了医学治疗，但在CNS疾病领域尚未充分实现其潜力。全球约5500万人受痴呆症影响（阿尔茨海默病为最常见病因），超过500万人患帕金森病，抗体治疗虽在研究中，但CNS递送是关键瓶颈。已获批的抗Aβ单抗（如aducanumab、lecanemab）依赖极低CNS浓度产生药效，但这种策略并非对所有抗体都适用，且高外周剂量增加副作用风险和治疗成本。
研究人员指出，本研究证实HFn纳米颗粒可将共价偶联的抗体递送至脑内。1A11-HFn纳米颗粒在体外验证后，经TEM确认纳米颗粒完整性，DLS验证抗体偶联成功，并经BLI和ELISA确认对hTfR和BACE1的结合活性。体内评估显示，1A11-HFn纳米颗粒在第1天显著降低脑内Aβ
1-40水平，但药效不持久。PK profile与PD观察结果一致：第1天和第3天可检测到较高浓度，第7天不可检出。
研究人员进一步分析了清除动力学特征。1A11-HFn纳米颗粒从血浆清除迅速（第1天至第3天降低>55倍），这与HFn在啮齿类动物中的短半衰期一致（约2-3小时），而典型的IgG因新生儿Fc受体（neonatal Fc receptor, FcRn）介导的再循环具有较长半衰期（约3周）。相比之下，纳米颗粒从脑内清除较慢（第1天至第3天降低约2.5倍，而血浆中>55倍）。但第3天脑内浓度（约6.2 nM）已不足以产生稳健的BACE1抑制效果。
研究人员将本研究与既往工作进行了比较。此前利用双特异性抗体（1A11-Nb62和1A11-Nb188）靶向TfR递送抗BACE1抗体，在约2倍高剂量下，双特异性抗体第1天脑内浓度分别约为纳米颗粒偶联物的7倍和5倍，Aβ
1-40降低约50%（接近最大值），而纳米颗粒偶联物仅约20%。双特异性抗体脑清除更快，而外周清除更慢。
研究人员也讨论了安全性考量。既往报道TfR靶向抗体可能存在网织红细胞计数急性但短暂降低的风险，消除抗体效应功能可缓解此问题。本研究中1A11的Fc结构域已引入LALA-PG突变（L234A、L235A、P329G）以消除效应功能，但未评估网织红细胞水平，这是本研究的局限性。
研究人员认为，尽管HFn和TfR靶向抗体均可实现抗体脑递送，但TfR靶向抗体似乎更高效。然而，纳米颗粒偶联物在特定应用中仍具优势，如小分子药物的脑靶向递送。HFn可通过尿素介导的解离/重组方法装载约33个阿霉素分子，通过铜介导配位可将装载量提高5倍，高压处理也可提高装载效率。此外，HFn内部腔室经工程化改造后可实现核酸类药物的静电封装，用于免疫激活或基因沉默治疗。
研究结论部分翻译如下：综上所述，这些发现证明HFn可作为有效的穿梭载体，在药理学相关浓度下将单克隆抗体递送穿越血脑屏障。该工作为HFn基纳米颗粒作为脑靶向生物治疗递送的有前景平台提供了基础性证据。此外，研究人员也指出，若仅考虑将抗体递送至脑内，构建含抗TfR1结合臂的双特异性抗体可能是更直接高效的策略；但纳米颗粒偶联物在联合小分子药物递送、特定细胞靶向等应用场景中具有独特优势，HFn作为药物递送平台的显著多功能性值得进一步探索。
