基于单核苷酸多态性（SNP）的菌株特异性鉴定PCR方法的发展与应用：以Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL-99为例，结合PCR技术和Sanger测序方法进行鉴定

《Journal of Microbiological Methods》：Development and application of a SNP-based strain-specific identification PCR method for Bifidobacterium animalis subsp. lactis BL-99 using PCR coupled with sanger sequencing

【字体：大中小】 时间：2026年06月04日 来源：Journal of Microbiological Methods 1.9

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　　宋志全|姜秋月|焦颖欣|何健|陈亚伟|赵文|刘一茹|马霞|葛园园|陈胜|苏瑶中国国家食品与发酵工业研究院有限公司，中国工业微生物菌种保藏中心，北京100015，中国摘要准确鉴定益生菌的菌株特性对于确保产品的有效性和安全性至关重要。然而，包括全基因组测序在内的许多现有技术由于成本、

宋志全|姜秋月|焦颖欣|何健|陈亚伟|赵文|刘一茹|马霞|葛园园|陈胜|苏瑶

中国国家食品与发酵工业研究院有限公司，中国工业微生物菌种保藏中心，北京100015，中国

摘要

准确鉴定益生菌的菌株特性对于确保产品的有效性和安全性至关重要。然而，包括全基因组测序在内的许多现有技术由于成本、速度和实用性方面的限制，在工业应用中存在挑战。为了解决这一问题，我们开发了一种新型的基于PCR结合Sanger测序的方法，用于鉴定Bifidobacterium animalis亚种lactis BL-99菌株。该方法通过整合泛基因组SNP筛查和优化的引物设计，成功识别出一种能够区分BL-99与其他B. animalis菌株的独特鸟嘌呤SNP。验证结果显示，在55种微生物菌株中该方法具有100%的特异性，在纯培养物中的检测限为10⁵ CFU/mL，并且在工业发酵样品中表现一致。这种方法降低了鉴定成本，避免了商业益生菌产品中的错误标签风险，为乳制品制造商提供了快速的质量控制工具和合规性评估手段。

引言

自20世纪中叶益生菌概念被提出以来，对其特性和功效的研究不断深入，推动了该行业的显著发展（Cunningham等人，2021年）。益生菌因其健康益处而获得了消费者的广泛认可，市场需求持续增长。益生菌的核心属性包括活性状态、足够的数量以及促进健康的功能（FAO/WHO，2002年）。鉴于其菌株特异性的功能性和安全性，精确的菌株鉴定对于保证产品质量至关重要（Cassir等人，2016年；Shehata和Newmaster，2021年）。

随着生物技术的进步，益生菌的鉴定方法也迅速发展（Morovic等人，2016年）。表型分析方法如生化谱型分析（例如VITEK系统）和MALDI-TOF质谱分析提供了快速且经济有效的解决方案，但由于数据库覆盖范围和分辨率的限制，在区分密切相关的菌株时存在不足（Angelakis等人，2011年；Felber等人，2023年）。虽然16S rRNA基因测序是细菌分类的基石，但其分辨率不足以区分密切相关的物种或亚种（Kim等人，2014年）。因此，菌株级别的鉴定通常建立在物种级别特征的基础上，这对行业来说仍然是一个持续的挑战。

目前推荐多种方法用于益生菌的菌株级别鉴定，包括全基因组测序（WGS）、多位点序列分型（MLST）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）和随机扩增多态性DNA（RAPD）（Cibik等人，2000年；Poluektova等人，2017年；Taboada等人，2013年）。然而，MLST、PFGE和RAPD在区分同源菌株时的分辨率有限。尽管WGS提供了全面的遗传数据和高可靠性，但由于成本高昂和数据分析复杂，特别是在工业环境中，其在常规应用中存在局限性。一个关键问题是密切相关的菌株之间的基因组相似度非常高（>99%）。为了解决这个问题，可以利用WGS数据生成的菌株特异性分子标记来开发快速、精确的基于PCR的定量方法，结合高分辨率和实际的可扩展性（Song等人，2024年）。值得注意的是，美国药典委员会的《化学品法典》（FCC）已经为Bi-07、HN019、Bi-26、LPC-37、HN001、LGG和NCFM等商业菌株发布了菌株特异性PCR检测方法（美国药典委员会，2022年）。

Bifidobacterium animalis亚种lactis BL-99是一种耐胃酸和胆汁的益生菌，具有已证实的安全性，能够调节肠道微生物群、增强免疫反应、缓解肠道炎症和功能性消化不良，并改善肠道屏障功能（Chen等人，2022年；Lan等人，2022年；Lu等人，2021年；Zhang等人，2024年）。BL-99的菌株特异性优势凸显了其在益生菌产品中准确鉴定的重要性。此外，其商业化需要在生产过程中严格控制一致性和强大的知识产权保护。建立精确的鉴定方法对于确保产品质量、促进个性化开发以及保护消费者健康至关重要。因此，需要一种快速、灵敏且特异的BL-99菌株鉴定方法，以便应用于商业益生菌产品的质量控制和合规性评估。本研究旨在开发一种快速检测方法，用于在生产过程中准确鉴定B. animalis亚种lactis BL-99，为其更广泛的应用提供技术支持。

章节摘录

细菌菌株和培养条件

本研究共使用了56种细菌菌株，其中17种为B. animalis菌株，38种来自其他物种（表1）。这些菌株分别来自中国工业微生物菌种保藏中心（CICC）和哥德堡大学菌种保藏中心（CCUG），其菌株编号分别为CICC和CCUG。所有菌株均在特定的温度、氧气条件和培养基下培养48小时，具体细节见表1。

基因组DNA提取和测序

BL-99

基因组分析

对B. animalis亚种lactis BL-99的完整基因组进行了测序，发现其具有1,935,344个碱基对的单环染色体，不含质粒（图1）。该基因组的GC含量为60.49%，包含1566个预测的编码序列（CDS）。通过InterPro（IPR）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、基因本体（GO）和同源基因簇（COG）数据库的验证，为其中1379个（88.05%）CDS分配了功能注释。

泛基因组分析

在

讨论

人们对有益微生物在人类健康中作用的理解不断加深，推动了含益生菌食品的市场需求增加（Ansari等人，2019年；Reid，2015年）。益生菌的特性与质量控制和安全性相关，表现出物种或属特异性的模式（Quigley，2019年），但更重要的是依赖于菌株特异性的属性（McFarland等人，2018年；Sanders等人，2018年）。使用未经验证的菌株可能无法再现临床确认的益生菌效果

结论

总之，本研究开发了一种可靠的PCR-Sanger测序方法，用于特异性鉴定B. animalis亚种lactis BL-99，该方法针对一个独特的菌株特异性单核苷酸多态性（SNP）。该检测方法显示出100%的特异性，成功区分了BL-99与54种非目标微生物菌株，并实现了10⁵ CFU/mL的一致检测限。重要的是，目标SNP在连续10次传代培养和5次

CRediT作者贡献声明

宋志全：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，方法学设计，数据分析，概念构思。姜秋月：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，数据可视化，项目管理，数据分析，概念构思。焦颖欣：撰写 – 原稿，实验设计，数据分析。何健：撰写 – 审稿与编辑，项目监督，资金获取。陈亚伟：数据可视化，

资助

内蒙古国家乳制品技术创新中心青年基金项目的财政支持（项目编号：2024-QNJJ-007）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

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