血管生成素（Angiogenin, ANG）在阿尔茨海默病中的性别特异性调控

《Molecular Psychiatry》：Sex-specific regulation of angiogenin in Alzheimer’s disease

　　

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种具有高度异质性的神经退行性疾病，识别新型分子调控因子对于开发有效治疗方案至关重要。血管生成素（angiogenin, ANG）是一种应激响应性核糖核酸酶（ribonuclease, RNase），可通过生成5′-tRNA片段（tRNA-derived fragments, tiRNAs）抑制细胞凋亡，但ANG在AD中的表达及调控机制尚不明确。本研究中，研究人员利用AD细胞和动物模型、人死后脑组织以及转录组数据集（n=645），系统考察了ANG的表达及调控模式。研究发现，ANG在AD中存在性别依赖性的表达失调，并伴随下游5′-tiRNA^Gly-GCC水平的改变。进一步分析揭示了女性特异性的分子亚型，该现象在男性中未被发现：亚型1以低ANG水平、炎症反应增强和神经元死亡增加为特征；亚型2表现为较高的ANG表达和中等程度的病理改变；亚型3则以最高的ANG水平、炎症反应减弱、认知衰退减缓和生存期延长为特点。上述发现将ANG定位为AD中神经炎症和细胞凋亡的关键调控因子，为其作为治疗策略提供了重要依据。

该研究由Y.ang等人完成，发表于《Molecular Psychiatry》期刊，聚焦于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）中血管生成素（angiogenin, ANG）的性别特异性调控机制及其临床意义。

研究背景方面，AD是以突触和神经元丢失、认知衰退以及淀粉样蛋白-β（amyloid-β, Aβ）斑块和病理性tau蛋白积累为特征的渐进性神经退行性疾病。氧化应激失调、线粒体功能障碍和慢性神经炎症在AD发病机制中发挥核心作用，形成代谢障碍与神经退行性变的恶性循环。越来越多的证据表明，疾病表现和认知衰退速率方面的性别特异性差异是AD异质性的关键贡献因素。女性具有更高的AD终生发病风险，经历更快速的认知衰退和更重的神经病理负荷，即使在认知正常的个体中，其死后病理水平也高于男性。这些显著的性别差异提示应激响应和炎症通路中存在潜在的生物学变异，但其分子机制尚未阐明。在此背景下，识别调控AD疾病异质性的上游分子调节因子成为研究重点。

研究人员选择ANG作为候选分子开展研究。ANG是一种14.1 kDa的核糖核酸酶，广泛表达于人体组织。除其经典的促血管生成功能外，ANG还调控核糖体RNA转录和细胞应激适应。在氧化应激条件下，ANG切割成熟tRNA产生30-40个核苷酸的tRNA来源片段（tiRNAs），这些片段可调控翻译并促进应激颗粒形成。其中，5′-tiRNA^Gly-GCC尤为丰富，可通过干扰凋亡体（apoptosome）形成抑制细胞凋亡。ANG还与神经保护相关，其核糖核酸酶活性或结构稳定性降低的突变与肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）、帕金森病（Parkinson’s disease, PD）及潜在AD相关。然而，由于ANG分子量小（14.1 kDa）且等电点偏碱性（pI 9.5），在蛋白质组学流程中难以检测，加之转录本丰度低和测序深度限制，其在转录组数据中的代表性不足，导致ANG在AD中的作用尚不明确。鉴于ANG与细胞应激响应的紧密联系，研究人员提出其与AD相关的两条主要通路——炎症小体（inflammasome）介导的神经炎症和氧化防御通路——可能存在关联。基于上述背景，研究人员利用多种AD细胞和动物模型、人死后脑样本以及大规模转录组数据集，系统探究了以下问题：ANG表达及tRNA片段丰度在AD病理过程中是否存在性别特异性改变？其调控的分子机制是什么？ANG调控如何与下游炎症和凋亡通路相关联？

研究人员开展的这项研究首次揭示了AD中ANG蛋白表达的性别依赖性失调，伴随5′-tiRNA^Gly-GCC水平的改变以及女性中独特的炎症和氧化应激特征，而这些变化在男性中未观察到。该发现为理解AD的性别差异分子机制提供了新视角，强调了ANG作为神经炎症和凋亡调控因子的关键地位，并为性别特异性和亚型特异性的AD治疗策略开发奠定了理论基础。

研究采用的主要关键技术方法包括：人死后皮层脑组织样本（来源荷兰脑库，Netherlands Brain Bank, NBB，n=26）的蛋白质免疫印迹（Western blot）、实时定量PCR（RT-qPCR）和放射性[³²P]标记的Northern blotting分析；HEK293细胞及稳定表达野生型APP（APPwt）的HEK293 AD细胞模型的体外实验，包括鱼藤酮（rotenone）诱导的氧化应激处理、寡聚体Aβ_1-42处理、caspase-Glo^? 3/7凋亡活性检测、合成5′-tiRNA^Gly-GCC模拟物（mimic）和抑制剂转染实验；5×FAD转基因AD小鼠模型（3月龄和12月龄）的脑组织及外周器官分析；大规模转录组数据挖掘，包括老龄化、痴呆与创伤性脑损伤研究（Aging, Dementia, and TBI, ADTBI）数据库和宗教 orders 研究与记忆老化项目（Religious Orders Study and Memory and Aging Project, ROSMAP）队列（总计n=645），涵盖统一流形逼近与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP）降维、基于层次密度聚类的空间应用噪声算法（Hierarchical Density-Based Spatial Clustering of Applications with Noise, HDBSCAN）聚类分析、基因本体论（Gene Ontology, GO）通路分析、Kaplan-Meier生存曲线及Cox比例风险模型生存分析；以及死后脑组织mRNA测序（由Novogene公司外包完成）。

研究结果部分，"AD中ANG mRNA、蛋白及tRNA来源片段表达的性别特异性改变"部分：研究人员首先检测了NBB人死后皮层组织中ANG的表达变化。RT-qPCR显示，虽然ANG mRNA水平无统计学显著差异，但男性AD患者呈降低趋势，女性AD患者则呈增加趋势，且女性队列中ANG水平变异范围较大。[³²P]-Northern blotting分析显示，男性AD患者中5′-tiRNA^Gly-GCC水平显著低于非痴呆对照（non-demented controls, NDC），而女性则呈上升趋势。Western blot分析证实，男性AD患者ANG蛋白显著降低，女性AD患者则显著升高。为验证这一发现，研究人员分析了ADTBI和ROSMAP大规模RNA测序数据，结果一致显示男性AD患者ANG mRNA显著下调，女性AD患者显著上调。在5×FAD AD小鼠模型中，12月龄（而非3月龄）的转基因雄鼠皮层ANG蛋白显著降低，雌鼠则显著升高，与人样本模式一致；外周器官（肝、肾、肺、脾）中未观察到类似改变，提示ANG失调可能为中枢神经系统特异性。

"氧化应激抑制ANG表达并降低其抗凋亡功能"部分：为探究ANG失调的分子机制，研究人员在HEK293细胞中采用鱼藤酮（线粒体复合物I抑制剂）诱导氧化应激。Western blot和RT-qPCR显示，鱼藤酮处理后ANG mRNA和蛋白水平均降低，抗氧化剂维生素C共处理可恢复ANG蛋白水平，表明活性氧（reactive oxygen species, ROS）是ANG下调的关键介导因素。功能上，重组人ANG（recombinant human ANG, rANG）处理可显著降低HEK293细胞的caspase-3/7活性，而鱼藤酮处理则增加caspase活性；rANG预处理或后处理均可显著减轻鱼藤酮诱导的凋亡。同时，鱼藤酮处理后5′-tiRNA^Gly-GCC水平显著降低，与ANG下降趋势一致。

"Aβ暴露通过氧化应激依赖性机制下调ANG水平"部分：研究人员进一步考察Aβ对ANG的调控作用。在HEK APPwt细胞模型中，ANG蛋白水平显著低于对照；寡聚体Aβ_1-42处理进一步抑制ANG，而γ-分泌酶抑制剂DAPT处理可恢复ANG至对照的73%。维生素C同样可挽救APPwt细胞中的ANG水平，强化了Aβ诱导的氧化应激在ANG下调中的作用。功能实验显示，APPwt细胞中caspase-3/7活性显著增高，rANG处理可降低其活性；5′-tiRNA^Gly-GCC水平在APPwt细胞中显著降低。合成的5′-tiRNA^Gly-GCC模拟物处理可显著降低caspase-3/7活性，而其抑制剂则增加caspase活性，证实5′-tiRNA^Gly-GCC是ANG细胞保护活性的关键下游效应分子。上述细胞模型结果与男性AD患者中的观察一致，但与女性AD患者不符。

"炎症小体相关炎症基因表达在男女AD患者间存在差异并与ANG水平相关"部分：针对女性AD中ANG上调的现象，研究人员排除了17β-雌二醇直接诱导的可能性（雌二醇单独或与Aβ共处理均抑制ANG表达），转而考察炎症因素。Western blot显示，男性AD死后脑组织中NLRP3显著上调，NLRP1无显著变化；女性AD患者中NLRP1和NLRP3均呈降低趋势。ROSMAP转录组数据验证了这一模式：男性AD患者中NLRP1、NLRP3、IL-1β和iNOS等炎症标志物表达升高，而女性AD患者中这些标志物显著降低。相关分析显示，女性AD患者中ANG表达与上述炎症标志物呈显著负相关，高ANG水平个体表现出明显更低的炎症基因表达，支持ANG及其切割产物5′-tiRNA^Gly-GCC在女性AD中具有抗炎效应。

"ANG表达定义女性AD患者内的分子不同亚型"部分：研究人员对ROSMAP女性AD队列进行UMAP降维和HDBSCAN聚类分析，发现三个 distinct 转录组簇，而男性AD及NDC、MCI组中未检测到类似聚类。三簇间ANG表达差异显著：簇1最低（均值=0.89），簇2（均值=1.35）和簇3（均值=1.47）依次增高。该聚类现象在NBB队列（队列2）和ADTBI队列（队列3）中得到独立验证。

"ANG相关亚型显示不同的炎症和抗氧化信号特征"部分：转录组分析显示，低ANG的簇1中促炎基因（NLRP1、NLRP3、IL-1β、iNOS、CXCL10）、急性期蛋白（SAA1）和趋化因子（CCL3）显著上调，稳态小胶质细胞标志物（TMEM119、TREM2）下调，抗氧化防御基因（Nrf2、CAT、SOD、HO-1、NQO1、GCLC、GCLM、TXNRD1）表达降低。相反，簇2和尤其是簇3中炎症反应减弱，抗氧化基因上调，Nrf2表达增加伴随其抑制因子Keap1下调。三队列联合分析（n=199）确认了三个稳健亚型：亚型1以高炎症、低抗氧化信号为特征；亚型3以低炎症、高抗氧化防御为特征；亚型2为中间表型。

"ANG相关女性AD亚型在生存和临床结局方面存在差异"部分：生存分析显示，亚型1平均生存期最短（1.5年），亚型3最长（2.8年，约为亚型1的近两倍，风险比hazard ratio, HR=0.47，即死亡风险降低53%，p=0.04），亚型2居中（HR=0.78，p=0.39）。认知方面，简易精神状态检查量表（Mini-Mental State Examination, MMSE）评分从诊断到死亡的变化显示，亚型1认知衰退最显著（平均丢失9分，终末MMSE=13），亚型2（平均丢失7分，终末MMSE=14）和亚型3（平均丢失6分，终末MMSE=16）衰退较慢。男性AD患者整体生存期（1.58年）和MMSE评分（终末=13）与女性亚型1相当。

讨论部分，研究人员提出女性AD的功能性亚型分类：亚型1可能代表具有增强神经元凋亡过程的神经炎症性表型，与男性表型相似；亚型2为具有独特小胶质细胞激活模式的部分保护性中间亚型；亚型3则表现为以活跃的小胶质细胞吞噬活性和延长总生存期为特征的稳态保护性表型。观察到的ANG mRNA和蛋白表达的性别特异性失调与先前有限的研究一致：Kim等报告以男性为主的队列中血清ANG降低，Wu等则观察到以女性为主的队列中ANG mRNA增加。这些一致性趋势表明性别特异性差异可能贡献于观察到的蛋白水平变化，但上述发现应被解释为关联性而非因果性。

为阐明ANG失调的分子机制，研究人员采用细胞模型发现ANG和5′-tiRNA^Gly-GCC的下调受氧化应激调控，鱼藤酮和Aβ抑制其表达，而抗氧化处理或γ-分泌酶抑制可恢复之。这与α-突触核蛋白过表达细胞中的发现一致——毒性α-突触核蛋白聚集体同样破坏线粒体复合物I、升高ROS并下调ANG。rANG的保护效应可能涉及Nrf2通路和氧化应激降低。5′-tiRNA^Gly-GCC作为下游效应分子，与ANG协同促进细胞存活。由于氧化应激单独不能解释女性AD中的ANG上调，研究人员进一步考察其潜在抗炎作用，发现ANG表达升高与女性AD患者亚群中NLRP3等炎症标志物降低相关，这与McManus等关于NLRP3抑制增强小胶质细胞吞噬功能和线粒体功能、促进改善Aβ清除的特定小胶质细胞表 tract 的发现相呼应。

关于女性AD分子亚型与已报道亚型框架的关系，研究人员指出这些亚型与Tijms等描述的脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）蛋白质组亚型高度吻合，后者同样与不同的遗传风险谱和转录组特征相关。亚型1与"先天免疫激活"CSF亚型相似，以显著促炎状态为特征；亚型3则可能反映更具保护性的表型，可能与"神经元可塑性"亚型重叠。女性患者中出现的这种神经保护性亚型3，与女性对脑老化具有更大神经韧性的新兴证据一致：女性似乎在疾病早期能更好地维持认知表现和海马体积以应对给定负荷的Aβ，但这种韧性可能在多年代偿后崩溃，导致诊断后加速认知衰退和快速海马萎缩。ANG相关的神经保护性亚型3可能代表了女性中保留代偿能力的分子特征。

研究结论指出，性别特异性的ANG表达失调及其与神经炎症、氧化应激和凋亡通路的关联，为理解AD的分子异质性提供了概念框架。ANG靶向治疗策略可能需要根据性别和分子亚型进行分层应用，而非对所有AD患者统一实施。对于ANG表达受抑的患者（如男性或神经炎症性亚型1女性），恢复ANG活性或增加其蛋白水平可能更为有益；而对于已处于高ANG表达状态的亚型3患者，进一步增加ANG可能无额外获益甚至破坏现有稳态。未来研究需结合单细胞和空间转录组学以及体内ANG信号操控，以验证这些亚型结构并更直接地考察潜在因果机制。