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细胞核是具有高度结构多样性与动态性的细胞器，锚定染色质并调控转录、复制、核糖体生物合成及核质运输等关键生命活动。解析核内大分子组装体的组织形式及其功能协调机制，需要能够在维持细胞天然结构的前提下实现亚分子分辨率的高分辨率成像方法。冷冻电子断层扫描（cryo-E
细胞核是具有高度结构多样性与动态性的细胞器，锚定染色质并调控转录、复制、核糖体生物合成及核质运输等关键生命活动。解析核内大分子组装体的组织形式及其功能协调机制，需要能够在维持细胞天然结构的前提下实现亚分子分辨率的高分辨率成像方法。冷冻电子断层扫描（cryo-ET）目前已可在原位提供分辨率达亚纳米尺度的细胞核三维结构视图。本综述系统阐述了cryo-ET如何重塑学界对细胞核生物学的认知，涵盖染色质组织结构、核孔复合体（NPC）的架构与动态特征，以及染色质-核纤层的相互作用机制。相关研究不仅解决了生物学领域的长期争议，还建立了核结构与功能的关联，为未来实现分子尺度与细胞尺度研究的贯通奠定了基础。
Visualizing the cellular landscape in 3D
cryo-ET的核心原理已在大量综述中详述，针对真核细胞应用的关键要点可归纳如下：真核细胞可直接在电镜载网上培养或滴加后投入液氮冷却的乙烷中进行 plunge-freezing，形成玻璃态冰以维持细胞的完整性及空间构象。厚度约200 μm以内的小型组织片段需采用高压冷冻（HPF）实现玻璃化，其通过高压下的液氮喷射抑制冰晶形成，保护细胞与分子结构。但当前玻璃化流程仍存在瓶颈，例如秀丽隐杆线虫（C. elegans）的成虫及胚胎常无法完全玻璃化，亟需优化以提升重复性。
由于多数真核细胞厚度超过cryo-ET成像阈值——高质量断层图像要求样品厚度低于约300 nm以减少非弹性散射、降低辐射损伤并维持信噪比，因此需对样品进行物理减薄。现有两种主流方法：冷冻超薄切片技术（CEMOVIS）利用冷冻超微切片制备薄样品；冷冻聚焦离子束铣削（cryo-FIB milling）已成为标准方案，其通过液态金属离子源或等离子体离子源产生的聚焦离子束逐步去除目标区域周围物质，稳定制备厚度通常为150–200 nm的薄层样品（lamella），可作为观察细胞内部及组织的透明窗口。当前cryo-FIB设备已配备lift-out技术，可从目标区域提取玻璃化样品块，转移至新载网后进行连续切片以适配cryo-ET成像需求。
减薄后的样品转入冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）采集断层数据：通过单轴倾斜样品，在不同角度下采集同一区域的二维投影图像，经计算重构获得三维体积。近期发展的拼接采集策略可将相邻倾斜序列拼接，扩大视场范围，适用于需要大范围高分辨率信息的核结构研究（如染色质组织分析）。直接电子探测器（DEDs）的应用是该领域的突破性进展，其可追踪并校正图像采集过程中的样品漂移，在低电子剂量条件下实现高分辨率成像。
该技术仍面临多项技术挑战：受限于样品与显微镜的倾斜几何结构，样品通常仅能倾斜至约±60°，导致部分角度信息缺失，即“缺失楔”效应，会造成结构沿电子束轴方向的人工拉长，降低断层图像的分辨率各向同性。此外，冰层厚度不均、lamella质量差异及样品荷电效应均会进一步降低图像质量。尽管细胞核整体易于识别，但在低信噪比、信息密度高的断层图像中定位特定核结构仍存在难度。
针对上述限制，相关解决方案正在发展：光电联用显微镜（cryo-CLEM）可通过荧光信号引导目标区域定位，集成式冷冻荧光-冷冻电镜平台可减少样品转移损耗；针对特定蛋白识别，已开发遗传靶向纳米金标记策略，通过功能性金纳米颗粒共价结合HaloTag标记的目标蛋白，兼具分子特异性、高电镜衬度与低扰动性，尤其适用于高密度的核环境。在计算层面，对齐算法、剂量加权及基于深度学习的断层图像去噪技术提升了图像保真度与衬度，机器学习方法可有效缓解缺失楔影响；近期开发的SPACEtomo等集成机器学习工作流可实现lamella检测、生物特征分割与自主靶点选择的端到端自动化采集，提升通量并减少操作偏差。上述进展共同推动了cryo-ET成为可在纳米尺度解析细胞结构与过程的成熟技术，尤其在核组装体原位成像方面提供了传统技术无法获得的染色质组织、核孔复合体架构及核纤层-染色质相互作用信息。
Unraveling the functional nuclear architecture by cryo-ET
细胞核是高密度区室，其结构复杂度与高度调控的功能紧密关联，染色质压缩程度、组蛋白修饰、核孔组织及核纤层架构的细微变化均可影响转录调控与基因组稳定性。cryo-ET可可视化上述结构改变，桥接结构生物学与细胞生物学，填补分子尺度组织与细胞水平行为的间隙，其独特优势在于可完整呈现目标区域周围的分子相互作用环境，提供传统技术无法获取的新颖信息。
Insight into chromatin architecture
自染色质首次被观察到以来，其组织结构与动态机制始终是细胞生物学的核心问题。基于生化与体外成像的经典模型提出染色质呈层级组织：核小体首先组装为10 nm的“串珠状纤维”，再进一步压缩为由连接组蛋白H1稳定的规则30 nm纤维，其中锯齿形与螺线管模型主导了近半个世纪的结构解释。然而cryo-ET对完整细胞核的直接成像始终未能证实规则30 nm纤维的存在，明确表明细胞内染色质组织具有不规则性与异质性，对传统模型提出了挑战。
通过cryo-FIB铣削结合cryo-ET及图像处理，可在天然核环境中可视化核小体并推断连接DNA。模板匹配（Template matching）与神经网络方法可用于识别核小体，随后进行亚断层平均（Subtomogram averaging, STA）；将平均得到的共识核小体结构按原始取向回贴（Back-mapping）至断层体积中，可通过类蠕虫链模型重构染色质纤维的三维构型，该方法分辨率高于10 ?，可检测此前无法观测的染色质组织微小变化。
在人RPE-1细胞中，染色质包装呈不规则状态，符合“类液体”组织模型，不存在周期性100–200 nm基序或有序纤维。检测到的最紧凑基序为有序堆叠的二核小体，而三核小体与四核小体堆叠及并列二核小体未形成明确结构类别，提示堆叠方式具有高度变异性，支持染色质可呈现多种构象的柔性组织模式。在未成熟T淋巴母细胞中，核周异染色质呈现20–50 nm的纤维宽度，由锯齿形核小体阵列与富含连接DNA的区域及无核小体区段交替组成；定量分析显示核小体间距约为120 ?，密度低于经典纤维模型的预期，表明其组织具有柔性与环境依赖性。静息T淋巴细胞核周的类似区域也观察到约50 nm厚的致密核小体层，该区域核小体的STA显示H1结合的DNA环绕核小体二联体的特征性取向，影响核间连接DNA的轨迹；该区域核小体浓度范围为10–400 mg/mL，常为核平均DNA浓度（约10 mg/mL）的10倍以上，核小体对的短程接触位于7 nm与11 nm，但无长程有序性，符合液-气中间态而非紧密堆积的30 nm纤维特征。
上述研究表明cryo-ET可为核膜处的染色质组织问题提供关键见解，提示间期染色质组织具有异质性、柔性与密度可变性，连接长度与核小体取向的差异可贡献染色体结构的复杂性，且不同细胞类型与细胞状态的染色质架构存在特异性。值得注意的是，T淋巴细胞与RPE-1细胞的lamin A/C表达水平较低，而lamin及其结合蛋白对核膜处乃至全核的染色质组织具有重要调控作用，这也为后续研究提供了方向。
Lamina–chromatin interactions
核纤层是染色质与核膜之间的结构与调控界面，主要由A型与B型lamin及其结合蛋白组成，提供机械支撑并锚定被称为核纤层相关结构域（LADs）的染色质区域。核纤层的结构研究长期受限于其纳米级架构的成像需求及体外重构lamin纤维的难度，cryo-ET可在天然细胞环境中直接可视化核纤层结构。
对去污剂处理细胞的cryo-ET研究显示，两类lamin均组装为直径约3.5 nm的细丝。近期研究揭示了lamin的功能差异：lamin A/C与B型lamin（B1/B2）对核周染色质密度的影响不同，敲低A型lamin会降低核纤层约100 nm范围内的核小体密度，而敲低B型lamin仅影响最外围区域。结构上，lamin A的尾部结构域可直接结合核小体，该特征在B型lamin与lamin C中缺失；lamin A的尾部具有柔性，可与距离纤维约30 nm内的染色质发生直接相互作用，此外核纤层与染色质的相互作用也可通过LBR、LAP2等蛋白介导，或与lamin A的表达水平相关。
上述结构观察具有重要的功能意义：全基因组分析显示，A型lamin敲低会导致大规模染色质重塑与转录改变，而B型lamin敲低主要影响核形态与核膜完整性，对染色质可及性的影响较小。两类lamin均会影响核孔复合体附近的染色质定位，表明lamin与核孔共同调控基因组组织。该研究证明，基于cryo-ET的细胞核可视化可在天然背景下提供结构信息，从而解析核纤层如何将高阶结构组织与完整细胞内的基因组组织相整合。
Nuclear pore complexes
核孔复合体（NPC）是细胞内最大的蛋白组装体之一，介导核质之间的选择性运输，由约30种核孔蛋白（nucleoporins）排列成多个亚复合体，估计分子量约为100 MDa。早期对分离核膜的cryo-ET研究获得了对称支架的详细模型，但无法捕获体内的构象变异性。
cryo-FIB铣削结合cryo-ET可从薄层样品重构NPC并获得更高分辨率。对人、酵母及藻类细胞的NPC结构分析揭示了显著的物种差异，且完整细胞内的NPC直径大于纯化样品的估计值，其中央通道直径可比既往估计大75%，凸显了天然细胞环境对NPC构象的影响。进一步研究显示NPC架构具有动态性与机械敏感性：酵母的NPC支架在指数生长期扩张，而在渗透休克或能量耗竭时收缩，中央通道体积可减半，该变化可逆且与核体积缩小相关，提示核膜的膜张力可调控NPC直径，为核力学与核质运输的关联提供了结构基础，对细胞迁移与分化等过程中核力学变化调节局部核孔直径的机制具有重要意义。
NPC的柔性核篮结构近期也在原位得到解析：酵母的NPC核面伸出8条丝状物，汇聚形成闭合环状的篮基；哺乳动物细胞的核篮更具柔性且开放，可能反映了结构柔性而非元件缺失。核篮可形成排斥区阻止染色质靠近NPC，与核孔通过门控转录活性调控基因表达的假说一致。核篮核孔蛋白的动态行为提示NPC可通过采用不同构象与分子组成实现功能特化。近期原位cryo-ET结合活细胞成像显示，Ran依赖的运输梯度可主动赋予NPC外周核孔蛋白不对称性，从而调控核质运输。
cryo-ET还揭示了NPC周转与病毒核输入机制：酵母中NPC可通过核膜出芽形成包含NPC的疝囊，随后通过自噬降解；HIV-1感染研究中，光电联用cryo-ET证实宽度约60 nm的完整锥形病毒衣壳可通过扩张的NPC，解决了既往模型中NPC通道过窄的矛盾。除直径变化外，病毒核心进入过程中还会发生明显的核孔变形，NPC的机械重塑与衣壳的内在力学特性共同调控导入效率，支持衣壳在穿核孔时发生力依赖的收缩模型。这些发现体现了cryo-ET通过原位结构快照捕捉动态细胞事件的能力，天然细胞环境的保存与高分辨率结构信息对理解核膜功能至关重要。
Ribosome biogenesis and nucleolar organization
核仁是无膜细胞器，通过液液相分离形成，专司核糖体生物合成。单颗粒冷冻电镜（single-particle cryo-EM）已解析了多个核糖体前体中间体的原子结构，但依赖纯化样品，常遗漏瞬时或环境依赖的相互作用。cryo-ET可在天然状态下可视化核仁，揭示核糖体前体在成熟过程中的空间组织。
断层分析显示核糖体前体呈梯度分布，颗粒大小与成熟度从核仁中心向周边逐渐增加。小亚基加工体作为组装支架局限于核仁特定区域，而更成熟的复合物定位于核质侧。这些结果为核仁区室化源于浓度梯度与多价相互作用的模型提供了直接分子证据，符合液液相分离原理。同时cryo-ET鉴定出了纯化样品中缺失的密度与辅因子，再次强调了核过程原位研究的重要性。
Perspectives and future directions
高分辨率成像已深刻改变了学界对核与细胞组织的认知，cryo-ET通过在天然环境背景下重构核组装体的分子尺度结构，正重塑细胞核生物学领域。前述研究涵盖染色质异质性、核孔复合体架构与机械敏感性、核仁梯度及核纤层-染色质偶联，为理解细胞核的动态结构逻辑提供了前所未有的视角。随着cryo-ET方法的持续发展，其有望推动核组织与功能的更多重大发现，包括核凝聚体形成、发育与细胞分裂过程中的三维染色质组织原则、核破裂与修复机制、病毒核进入与基因组整合等过程的研究。在机械生物学领域，分子分辨率的结构信息为关联力诱导的构象变化与细胞功能提供了有力框架。
然而cryo-ET的全部潜力尚未释放，单个断层图像的低信噪比仍限制了细节提取，而细胞场景的独特性常使其无法进行平均处理，提升单断层图像分辨率仍是核心技术挑战。近期激光相位板、氦温冷冻电镜等技术的发展有望增强衬度并保留高分辨率信息；直接电子探测器、自动化采集流程与高通量成像工作流的进步持续提升数据质量与效率；光电联用成像、膨胀显微与time-resolved cryo-ET等整合成像方法则通过关联超微结构与时空细胞背景拓展了研究框架。此外，玻璃化策略创新、可处理样品范围的扩大、黏附细胞优化基底及冷冻前可控机械化学扰动，将进一步提升细胞cryo-ET的生理相关性与实验灵活性。
在计算层面，深度学习驱动的去噪、分割与颗粒识别方法正突破噪声数据的限制，可在单个断层图像中直接检测低拷贝数或短寿命的大分子复合物，推动该领域向“视觉蛋白质组学”的长期愿景迈进。上述进展共同确立了cryo-ET在分子组织可视化领域的领先地位，为解析塑造细胞功能的结构提供了前所未有的研究手段。
