《OncoImmunology》：Umbilical cord blood natural killer cells improve anti-GD2 antibody efficacy in neuroblastoma: from mouse to human
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尽管抗双唾液酸神经节苷脂（GD2）免疫治疗取得了进展，但高危型神经母细胞瘤（NB）仍然是临床挑战。自然杀伤（NK）细胞介导的抗体依赖性细胞毒性是抗GD2抗体的一种有效作用机制。然而，剂量密集化疗会导致NK细胞耗竭。在本研究中，研究人员首次在临床样本中观察到肿瘤
尽管抗双唾液酸神经节苷脂（GD2）免疫治疗取得了进展，但高危型神经母细胞瘤（NB）仍然是临床挑战。自然杀伤（NK）细胞介导的抗体依赖性细胞毒性是抗GD2抗体的一种有效作用机制。然而，剂量密集化疗会导致NK细胞耗竭。在本研究中，研究人员首次在临床样本中观察到肿瘤内NK细胞浸润与抗GD2疗效之间的正相关。随后，研究人员确立了离体扩增和激活的脐带血（UCB）来源NK细胞在细胞毒性、持久性、抵抗耗竭和安全性方面的独特优势（从前临床模型到临床病例），并与患者来源的外周血（PB）NK细胞进行了比较。抗GD2抗体进一步增强了UCB NK细胞在功能状态、持久性和重塑免疫激活肿瘤微环境方面的优势。UCB NK细胞与抗GD2联合治疗在体外和小鼠中产生协同效应，并在两例复发/难治性NB患者中达到完全缓解和部分缓解，无附加毒性。机制上，抗GD2抗体在UCB NK细胞中诱导了“高激活-低抑制”表型，并且与抗GD2联合治疗时，供者UCB NK细胞显示出比受者NK细胞更低的免疫检查点水平和更高的记忆样标志物水平。总体而言，本研究是UCB NK细胞联合抗GD2治疗在NB中的首次转化研究，将前临床机制洞见桥接到早期临床概念验证。一项关于UCB NK细胞输注联合抗GD2治疗高危、复发/难治性NB患儿的I期研究正在研究人员中心进行（NCT06631391）。
**论文解读：脐带血自然杀伤细胞联合抗GD2抗体在神经母细胞瘤中的转化研究**
**研究背景与问题**
神经母细胞瘤（neuroblastoma, NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤，约占儿童癌症相关死亡病例的15%。约半数患者初诊时即为高危型疾病，对于一线治疗失败的患者，长期生存率低于10%。近几十年来，抗双唾液酸神经节苷脂（GD2）单克隆抗体（Ab）免疫治疗已作为标准治疗手段，显著改善了患者预后，但高危型NB患者的存活率仍仅约60%，表明亟需开发新型有效的免疫治疗策略。自然杀伤（natural killer, NK）细胞通过抗体依赖性细胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC）在抗GD2抗体抗肿瘤免疫中发挥关键作用。然而，患儿外周血（peripheral blood, PB）和肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中NK细胞频率低，剂量密集化疗进一步损害NK细胞免疫功能。此外，FCGR3A基因型降低、抑制性TME等障碍也削弱了NK细胞介导的ADCC。既往尝试将离体扩增的NK细胞输注与抗GD2疗法结合，但单倍体NK细胞面临人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）排斥、扩增不足和输注后短暂持久性等问题；自体NK细胞因既往细胞毒性治疗而存在不可逆功能损伤。嵌合抗原受体T细胞和NK T细胞免疫疗法虽具效力，但安全性风险较大。因此，研究人员聚焦于脐带血来源的NK细胞（UCB NK cells），其不仅具有优越的细胞活力和细胞因子分泌能力，还表达高水平的C-X-C基序趋化因子受体4，可能促进肿瘤归巢。本研究旨在探索扩增激活的UCB NK细胞联合抗GD2抗体在NB中的抗肿瘤效力、表型特征及安全性，并报告两例复发/难治性NB的临床证据。该论文发表在《OncoImmunology》。
**主要技术方法**
研究人员使用了以下关键技术方法：从供者脐带血（UCB）和NB患者外周血（PB）中分离并离体扩增激活NK细胞；采用xCELLigence实时细胞分析和免疫荧光共培养实验评估NK细胞对GD2阳性NB细胞系的杀伤能力及ADCC效应；构建NOG小鼠皮下和原位异种移植NB模型进行体内疗效评估；通过流式细胞术检测NK细胞表面活化/抑制受体、细胞毒性分子（CD107a、穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ、TNF-α）的表达；采用RNA测序（RNA-sequencing）分析小鼠肿瘤异种移植物和患者配对肿瘤组织的转录组特征；使用半定量人细胞因子抗体芯片检测患者血清中120种细胞因子的变化；开展一项I期临床试验（NCT06631391），纳入8例高危、复发/难治性NB患儿（来自中山大学肿瘤防治中心），其中两例代表性病例详细报告了联合治疗的安全性与疗效。
**研究结果**
**1. NK细胞浸润与抗GD2疗效及患者生存的相关性**
通过NKp46免疫组化染色评估NB患者肿瘤组织中的NK细胞浸润，发现达到完全缓解（CR）的患者较非CR患者具有显著更高的NK细胞浸润。高NK细胞浸润倾向与更长的无事件生存期（EFS）相关。在131例NB患者队列中，高NK细胞浸润与有利的EFS和总生存期（OS）相关，单变量和多变量Cox回归分析证实高NK细胞浸润是NB患者EFS和OS的独立预后因素。
**2. UCB NK细胞在抗GD2抗体作用下介导更强的ADCC**
与PB NK细胞相比，离体扩增激活的UCB NK细胞对GD2阳性和GD2阴性NB细胞均表现出更强细胞毒性。添加抗GD2抗体后，两种NK细胞对GD2阳性NB细胞的杀伤显著增强，且UCB NK细胞介导的ADCC效应更强。xCELLigence实时分析证实UCB NK细胞联合抗GD2抗体具有更强的ADCC选择性。
**3. UCB NK细胞表达更高水平的细胞毒性分子，抗GD2抗体进一步增强**
UCB NK细胞在CD107a、穿孔素、颗粒酶B、IFN-γ和TNF-α的表达上显著高于PB NK细胞。与肿瘤细胞共培养后，这些分子在两种NK细胞中均被抑制，但添加抗GD2抗体后，UCB NK细胞中所有分子表达显著回升，而PB NK细胞恢复不完全，表明抗GD2抗体可有效逆转NB细胞对UCB NK细胞的功能抑制。
**4. 抗GD2抗体介导UCB NK细胞更显著的“高激活-低抑制”受体表型**
UCB NK细胞相较于PB NK细胞，活化受体（NKp30、NKp44、NKG2D）表达更高，抑制受体（CD158、NKG2A、ILT2）表达则呈现差异（CD158、NKG2A较高，ILT2较低）。共培养时，抗GD2抗体使UCB NK细胞活化受体进一步上调、抑制受体下调，而PB NK细胞变化不显著，表明UCB NK细胞具有更明显的“高激活-低抑制”表型及对抗GD2抗体的更强应答。
**5. 过继转移UCB NK细胞改善小鼠NB模型中抗GD2抗体的疗效**
在原位NB模型中，单纯UCB NK细胞输注抑制肿瘤生长强于PB NK细胞；联合抗GD2抗体后，UCB NK细胞组肿瘤负荷显著降低，所有5只小鼠直至第50天均保持完全消退（CR），而PB NK细胞联合组未达到完全消退。UCB NK细胞联合组循环NK细胞数量、肿瘤内NK细胞浸润及颗粒酶B表达显著增加。RNA测序显示联合治疗富集多个免疫激活信号，与NK细胞耐受诱导及TGF-β信号通路上调呈负相关。此外，PD-1/PD-L1信号适度富集，但抗PD-1/PD-L1抗体在体外对UCB NK细胞联合抗GD2抗体的杀伤能力无显著增强。
**6. UCB NK细胞联合抗GD2抗体对原代NB细胞的细胞毒性**
从3例高危NB患者分离的原代GD2阳性NB细胞中，UCB NK细胞表现出强效细胞毒性，且肿瘤细胞GD2表达越高，联合抗GD2抗体后的杀伤优势越明显。
**7. 联合UCB NK细胞输注与抗GD2抗体在复发/难治性NB患者中的安全性与临床获益**
在8例入组患者中，中位随访14.0个月，未观察到疾病进展事件，最佳总缓解包括3例CR、4例部分缓解（PR）和1例疾病稳定，客观缓解率87.5%，疾病控制率100%。两例代表性病例显示：病例1（8岁男童，化疗耐药）接受UCB NK细胞输注联合naxitamab治疗后实现整体PR（骨髓CR、右股骨病变PR）；病例2（4岁男童，naxitamab维持后复发）接受UCB NK细胞输注联合dinutuximab治疗后达到CR（骨髓、骨骼及颅骨软组织病变均消退）。两例均未发生治疗相关不良事件。
**8. 供者UCB NK细胞的体内持久性与表型**
DNA嵌合分析（病例1）显示输注后第1天供者UCB NK细胞水平高，第7天骤降，第7~21天逐渐回升；流式细胞术（病例2）显示供者NK细胞在输注后第21天达到扩增峰值，第56天仍>20%，且第49天出现第二次扩增。表型分析表明，供者UCB NK细胞相较于内源性NK细胞，持续高表达活化受体（NKp30、NKp46、NKp44、CD16、CD69）和记忆样标志物（IL7R、CXCR6），低表达抑制受体（ILT2、CD158、NKG2A、PD-1、TIM3、LAG3）。活化受体在输注后1~14天持续上升，21~56天逐渐下降；抑制受体随时间相对稳定。PD-1表达在第35天后开始降低，第56天维持低水平，提示供者UCB NK细胞具有优越的抵抗功能耗竭能力。ADCC和CDC效应在多次输注后较基线显著增强。
**9. 联合治疗诱导“更热”的肿瘤微环境**
血清细胞因子分析显示治疗后淋巴细胞趋化、趋化因子介导信号通路及中性粒细胞/粒细胞趋化相关生物学过程上调，NK相关、巨噬细胞相关、中性粒细胞相关及Th1相关细胞因子和趋化因子增加，其中CXCL10成为蛋白-蛋白互作网络中的枢纽分子。患者的肿瘤组织RNA测序显示治疗后固有和适应性免疫应答协同激活，包括脂质代谢、NKT细胞活化、Th1细胞因子产生、肿瘤坏死因子应答、中性粒细胞趋化正向调节及NK细胞介导细胞毒性等通路富集；Fc-γ受体信号、C3b/C4b结合及补体激活显著上调，ADCC与CDC效应增强。NK细胞相关基因表达显示细胞毒性和活化特征上调，功能紊乱和应激特征下调。
**总结讨论**
本研究首次完整实现了从UCB来源NK细胞联合抗GD2抗体在NB中的转化研究，从前临床体外功能和动物模型验证到两例复发/难治性患者的临床应用，提供了新型“现成”联合免疫治疗策略。研究人员系统证实了UCB NK细胞相较于患者来源PB NK细胞的独特功能优势和分子特征，包括更强的细胞毒性、更稳定的“高激活-低抑制”受体平衡、体内持久性以及抵抗功能耗竭的能力。机制上，抗GD2抗体诱导UCB NK细胞的激活-抑制平衡放大，而PB NK细胞应答有限。研究还揭示了联合治疗重塑“热”免疫微环境，CXCL10可能作为疗效预测生物标志物。安全方面，UCB NK细胞展示出优越的安全性，对儿童患者尤为重要。研究局限性包括临床病例数少（8例）、需长期随访、缺乏免疫活性小鼠模型、需更多NB细胞亚型验证以及未进行KIR/KIR-配体基因分型。**研究结论**：本研究确定UCB NK细胞是NB免疫治疗的优越效应细胞来源，其特征为高激活-低抑制表型、强效应功能、长期体内持久性、抵抗功能耗竭以及在前临床模型和临床病例中的良好安全性。此外，UCB NK细胞联合抗GD2抗体在小鼠中展现出显著协同效应，并在复发/难治性NB患者中取得显著临床获益，从而提供了UCB NK细胞与抗GD2联合治疗的首项临床证据。研究结果支持UCB NK细胞作为整合安全性与有效性的独特治疗选择，以及改善抗GD2治疗NB疗效的有前景辅助手段。
