《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Cytoplasmic region of beta-dystroglycan is essential for postsynaptic maturation and neuromuscular function in mice
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肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物（dystrophin–glycoprotein complex, DGC）为肌膜（sarcolemma）提供结构完整性，其破坏会导致肌营养不良（muscular dystrophy）。DGC的核心成员是肌营养不良糖聚糖（dystr
肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物（dystrophin–glycoprotein complex, DGC）为肌膜（sarcolemma）提供结构完整性，其破坏会导致肌营养不良（muscular dystrophy）。DGC的核心成员是肌营养不良糖聚糖（dystroglycan, DG），它通过α-DG（α-dystroglycan）结合细胞外配体，通过β-DG（β-dystroglycan）结合细胞内细胞骨架。DAG1基因或参与DG翻译后加工的基因突变会导致一组称为肌营养不良糖聚糖病（dystroglycanopathies）的神经肌肉疾病。虽然α-DG的细胞外相互作用的重要性已得到确立，但关于β-DG细胞内相互作用的意义知之甚少。在此，我们研究细胞内β-DG在神经肌肉健康中的重要性。利用缺乏β-DG大细胞内区域（残基777至893）的小鼠，我们证明胞质β-DG的缺失导致骨骼肌病理学伴随突触后结构破坏。数据表明，在特化的神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）内，胞质β-DG对于utrophin和rapsyn的定位以及乙酰胆碱受体（acetylcholine receptors, AChRs）的聚集是必需的。此外，我们提供证据证明突触后异常导致了缺乏β-DG胞质区域小鼠的神经肌肉功能障碍。进一步地，利用仅缺乏β-DG C端尾部（残基879至893）的小鼠模型，我们证明骨骼肌和NMJ健康依赖于β-DG残基777至878。总之，我们的小鼠模型表明，β-DG胞质结构域（cytodomain）的缺失出乎意料地在小鼠中导致了非常严重的神经肌肉病理生理现象。我们的结果确定了β-DG作为体内塑造和维持神经肌肉突触架构的关键参与者，从而进一步定义了神经肌肉健康的分子机制。
肌营养不良糖聚糖（dystroglycan, DG）作为肌营养不良蛋白-糖蛋白复合物（dystrophin–glycoprotein complex, DGC）的核心组件，在连接细胞外基质（extracellular matrix, ECM）与细胞内骨架以维持肌膜（sarcolemma）结构完整性方面发挥着至关重要的作用。尽管既往研究广泛聚焦于α-DG的细胞外糖基化修饰及其与ECM的结合能力，或DAG1基因的全局缺失导致的肌营养不良糖聚糖病（dystroglycanopathies），但对于β-DG独特的细胞内结构域，特别是其胞质区域在神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）突触后成熟及功能维持中的具体分子机制，长期以来存在认知空白。鉴于β-DG被认为通过与utrophin、dystrophin及rapsyn等蛋白相互作用来锚定乙酰胆碱受体（acetylcholine receptors, AChRs）并稳定突触后结构，但其体内生理重要性尚未在神经肌肉层面得到充分解析，本研究旨在填补这一知识缺口，探究β-DG胞质区域对骨骼肌健康及神经肌肉功能的决定性作用。
研究人员构建了两种特异性缺失β-DG胞质区域不同部分的转基因小鼠模型：一种是缺失最后117个氨基酸（残基777至893）的β-DGcyto模型，另一种是仅缺失C端尾部15个氨基酸（残基879至893）的β-DGtail模型。通过组织学分析、免疫荧光定位、离体肌肉收缩力测定以及体内运动功能测试，研究人员发现β-DGcyto小鼠表现出严重的胚胎 lethality（部分在胚胎早期死亡），存活个体呈现显著的骨骼肌病理特征，包括肌纤维大小不均、炎症浸润及DGC成分在肌膜定位紊乱。在神经肌肉层面，β-DGcyto小鼠的NMJ突触后形态严重碎片化，utrophin和rapsyn无法正确定位至突触后膜，导致AChRs聚集异常及神经支配失败。功能测试显示，这些小鼠表现出肢体蜷缩、握力显著下降及腓肠肌扭矩输出降低，且肌肉对离心收缩极度敏感。相比之下，β-DGtail小鼠各项指标均接近野生型，表明C端尾部对骨骼肌结构和功能非必需。该研究揭示了β-DG胞质区（残基777至878）对于维持DGC稳定性、NMJ突触后成熟及神经肌肉传导效率的关键作用，为理解原发性肌营养不良症及开发靶向DGC的疗法提供了新的分子视角。本研究发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences》。
研究人员主要利用基因工程小鼠模型技术开展研究。具体而言，研究人员构建并分析了两种条件性基因敲除小鼠模型：β-DGcyto小鼠（缺失β-DG胞质区残基777-893）和β-DGtail小鼠（缺失β-DG C端尾部残基879-893）。样本来源为上述转基因小鼠的骨骼肌组织（如腓肠肌、趾长伸肌）及神经肌肉接头部位，通过免疫荧光染色、H&E组织学染色、离体肌肉力学测试及体内运动行为学分析进行评估。
研究结果如下：
1. **β-DG胞质区域缺失导致骨骼肌病理学改变**
研究人员通过免疫荧光和H&E染色发现，β-DGcyto小鼠骨骼肌中DGC成分（如dystrophin、sarcoglycans）在肌膜定位紊乱，且出现肌纤维大小不一和炎症细胞浸润等营养不良性病理特征。离体肌肉功能测试显示，β-DGcyto小鼠趾长伸肌（extensor digitorum longus, EDL）的最大等长收缩力及比力显著低于对照组，且在经历离心收缩后肌力恢复能力极差，表明细胞内β-DG对维持骨骼肌机械强度至关重要。
2. **β-DG胞质区域对神经肌肉接头（NMJ）突触后成熟至关重要**
通过α-银环蛇毒素标记AChRs及神经轴突标记，研究人员发现β-DGcyto小鼠的NMJ突触后形态严重异常，呈碎片化分布，且伴随部分或完全去神经支配现象。免疫荧光分析显示，由于缺乏胞质β-DG，突触后膜上的utrophin和rapsyn表达下调且定位紊乱，进而导致AChRs无法有效聚集。这表明细胞内β-DG通过与utrophin和rapsyn相互作用，对NMJ突触后结构的组装和稳定具有不可替代的作用。
3. **β-DG胞质区域缺失导致神经肌肉功能障碍**
体内行为学测试显示，β-DGcyto小鼠表现出典型的神经运动疾病表型，如尾部悬吊时的四肢蜷缩（clasping）。握力测试显示其前肢握力显著降低，神经刺激诱导的腓肠肌收缩扭矩亦显著减弱。这些结果证实了突触后结构的破坏直接导致了整体神经肌肉功能的受损。
4. **β-DG C端尾部缺失不影响骨骼肌及NMJ功能**
与β-DGcyto模型不同，仅缺失C端尾部15个氨基酸的β-DGtail小鼠生存率正常，骨骼肌形态学、DGC蛋白定位、离体肌肉收缩力及体内运动功能均与野生型对照无显著差异。NMJ形态保持正常的“椒盐样”结构，utrophin和rapsyn定位正常。这表明β-DG与dystrophin的结合对于维持骨骼肌基本功能是可选的，或者存在其他补偿机制，而更靠近跨膜区的胞质区域（残基777-878）才是功能关键区。
讨论部分指出，虽然体外实验已提示β-DG胞质区与dystrophin、utrophin及rapsyn存在相互作用，但其在体内的生理意义一直不明确。本研究证实，β-DG胞质区的缺失破坏了DGC在肌膜的稳定性，更关键的是破坏了NMJ突触后膜的架构。研究人员认为，utrophin在突触后膜不仅替代dystrophin的功能，还介导rapsyn与AChRs的连接。β-DGcyto小鼠中utrophin定位的缺失进一步阻断了这一通路，导致AChRs簇集失败。此外，研究讨论了胚胎致死性的机制，指出β-DGcyto小鼠的部分胚胎致死可能与Reichert's膜形成障碍有关，这与Dag1全身敲除模型的表型一致。尽管β-DGtail小鼠证明C端尾部非必需，但近期冷冻电镜研究显示β-DG邻近跨膜区可能与dystrophin的ZZ结构域直接相互作用，暗示dystrophin可能通过多个位点结合β-DG。研究人员强调，虽然NMJ结构异常，但β-DGcyto小鼠仍能存活至成年，说明神经肌肉接头具有一定的可塑性或存在低水平补偿机制。
研究结论部分总结道：β-DG残基777至893的细胞内区域对于骨骼肌健康、神经肌肉接头（NMJ）的突触后成熟与维持、以及防止肌营养不良症的发生是必需的。肌肉功能依赖于该胞质区域来支持NMJ的结构完整性。这些发现扩展了人们对体内β-DG功能的分子理解，进一步阐明了神经肌肉健康的潜在分子机制。
