《Analytica Chimica Acta》：Harnessing a MMP-sensitive fluorescent probe for in-situ and reversible monitoring MMP alteration in dual color based on aggregation/monomer mechanism
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魏梦梦|张玉轩|强五友|刘家伟|钱毅|徐静|唐晓燕|刘娇娇|王申强|江婷旺|杨希峰|洪学坤|杨瑞电子与信息工程学院，江苏省先进功能材料重点实验室，苏州工业大学，中国苏州215500摘要背景线粒体是高度动态的细胞器，表现出多种功能状态。线粒体膜电位（MMP）在维持线粒体功能中起着至
魏梦梦|张玉轩|强五友|刘家伟|钱毅|徐静|唐晓燕|刘娇娇|王申强|江婷旺|杨希峰|洪学坤|杨瑞
电子与信息工程学院，江苏省先进功能材料重点实验室，苏州工业大学，中国苏州215500
摘要
背景
线粒体是高度动态的细胞器，表现出多种功能状态。线粒体膜电位（MMP）在维持线粒体功能中起着至关重要的作用，并作为细胞健康和活力的指标。因此，实时监测MMP的变化对于了解与线粒体相关的生物事件至关重要。直接的双色可视化可以减少由于染色不均匀和仪器不一致性导致的误差。然而，实现原位和直接检测动态MMP变化仍然是一个重大挑战。
结果
在这项研究中，我们设计并合成了一种新的荧光探针，用于原位、直接和双色可视化线粒体膜电位。该探针通过聚集/单体机制发挥作用。QI在多种状态下显示绿色和红色荧光，其粘度响应特性使其适用于高保真度可视化。在生理条件下，QI选择性地以红色通道标记线粒体，反映正常的MMP水平。当MMP下降时，绿色通道信号出现，红色荧光减弱，表明MMP丧失。这使得我们能够在多个时间点原位和直接观察到由CCCP（碳酰氰基3-氯苯腙）或H2O2引起的可逆MMP变化。因此，QI能够追踪凋亡过程中MMP的变化。
意义与创新
与其他用于MMP可视化的探针相比，这种探针能够原位和直接以双色可视化可逆的MMP变化。QI能够以双色可视化MMP变化并监测其在不同生理过程中的动态，具有重要的价值，有望推进关于MMP相关生理学和病理学的研究。
引言
作为具有双层膜的细胞器，线粒体在细胞生命活动中起着至关重要的作用。线粒体的形态和数量高度动态，其变化与多种生理和病理状况密切相关[1]、[2]、[3]。作为线粒体状态的指标，线粒体膜电位（MMP）是细胞健康的关键指标[4]、[5]。在正常条件下，MMP通常保持在–150至–180 mV的范围内，这一范围支持重要的线粒体过程，如信号转导[6]、ATP生成[7]、[8]和离子交换[8]。然而，即使是很小的偏离也会显著损害线粒体功能并导致线粒体功能障碍[9]。例如，MMP的下降通常是细胞功能障碍的标志，会触发自噬[10]、凋亡[11]和坏死[12]等过程。研究表明，MMP的降低可诱发多种疾病，包括癌症[13]、阿尔茨海默病[14]和糖尿病[15]。因此，敏感地检测细胞MMP的变化对于生物学研究和相关疾病的诊断至关重要。
作为重要的物理参数，MMP的测量已在生理和病理条件下得到了广泛研究[16]。然而，与生物分子或细胞器不同，MMP无法通过光学或电子显微镜直接可视化[4]。最初，使用微电极技术来测量MMP水平，因为其电压读数可以反映MMP的状态[17]、[18]。然而，线粒体的亚微米大小（直径0.75–3 μm）使得使用传统的电化学传感技术难以检测MMP[19]。此外，这种方法需要将线粒体从细胞中分离出来，这可能会影响细胞的完整性[4]、[19]、[20]。相比之下，荧光探针具有多种显著优势，如快速反应性、高选择性和敏感性，以及能够在不干扰细胞的情况下追踪生物事件[21]、[22]。因此，已经应用了多种荧光探针来监测MMP的变化。
最近，设计了基于两种机制的MMP评估荧光探针，包括荧光强度变化或亚细胞迁移[4]。例如，商业探针如罗丹明123和TMRE通过荧光强度变化来监测MMP的变化[23]、[24]。然而，基于荧光图像很难区分MMP的降低和完全消失状态。随后，开发了具有亚细胞迁移特性的探针。Yu等人开发了两种探针，当MMP去极化时，这些探针会从线粒体转移到细胞核/溶酶体[25]、[26]。Lin等人开发了一种荧光探针，当线粒体去极化时，该探针会从线粒体转移到核仁[27]。相比之下，直接的双色可视化MMP变化可以减少由于染色不均匀和仪器不一致性导致的误差。然而，关于能够同时和直接以双色可视化MMP变化的单一探针的研究很少报道。
在这里，我们设计并合成了一种新型荧光探针，通过聚集/单体机制实现MMP的双色成像。QI具有绿色和红色荧光的双重发射特性，可以在绿色和红色通道中进行成像，其粘度响应特性使其能够实现高保真度成像。在生理条件下，QI选择性地以红色通道标记线粒体，反映正常的线粒体膜电位（MMP）水平。然而，随着MMP的下降，绿色通道中的线粒体形态发生变化，红色荧光减弱。因此，可以原位和双色观察到由CCCP或H2O2引起的MMP变化，并且这种方法允许追踪凋亡过程中的MMP波动。
章节片段
化合物QI的合成
将化合物2（0.315克，1毫摩尔）和吲哚-3-甲醛（化合物3，0.145克，1毫摩尔）溶解在20毫升无水乙醇中。加入8滴哌啶得到黄色溶液，首先搅拌反应系统1小时，然后回流8小时以确保完全转化。冷却至室温后，通过真空过滤分离出生成的固体。进一步使用硅胶柱进行纯化
QI的分子设计与制备
本研究旨在开发一种具有双色发射特性的荧光探针，用于可视化MMP变化（图1A）。该探针需要满足三个关键标准：（1）双色荧光，（2）特异性靶向线粒体，（3）MMP依赖的双重发射。在我们之前的研究中，带有阳离子盐的结构（如喹啉盐和噻唑盐）可以实现线粒体靶向，因为它们的正电荷促进了线粒体的积累
结论
总之，我们开发了一种新型荧光探针，能够直接、双色成像线粒体膜电位并监测凋亡。QI在溶液和固态下都具有绿色和红色荧光特性，可以实现绿色和红色通道的同时成像，其粘度响应特性能够实现高保真度成像。在生理条件下，QI选择性地以红色通道标记线粒体，表明
CRediT作者贡献声明
徐静：方法学、数据管理。王申强：验证、调查、正式分析。江婷旺：项目管理、方法学、正式分析。唐晓燕：方法学、数据管理。刘娇娇：软件、项目管理。杨瑞：写作——审稿与编辑、验证、监督。张玉轩：项目管理、调查、正式分析。强五友：可视化、软件、资源。杨希峰：资金获取、正式分析、数据
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：12204067、62074019）、江苏省自然科学基金（BK20220689）、江苏省教育厅的自然科学研究项目（22KJB140006）、中国博士后科学基金（2024M750301）以及苏州工业大学的启动基金（KYZ2021055Q、KYZ2021056Q）的财政支持。
