《Aquaculture》：Transcriptome-based SNP identification of sex-associated SNPs and a plausible role of RNA editing in discrepancies between RNA- and DNA-derived sex-associated SNP markers in snakeskin gourami
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张明华|Phonsiri Khanakorn|Thongchaitriwat Sirijanya|Kubota Satoshi|S. Boonanuntanasarn泰国那空拉差西玛技术大学农业技术学院动物技术与创新学院，大学大道111号，Nakhon Ratchasima 30
张明华|Phonsiri Khanakorn|Thongchaitriwat Sirijanya|Kubota Satoshi|S. Boonanuntanasarn
泰国那空拉差西玛技术大学农业技术学院动物技术与创新学院，大学大道111号，Nakhon Ratchasima 30000
摘要
鱼类中的性别相关标记在生态学和水产养殖研究中非常有用，可以用于监测自然种群中的性别比例，支持生态保护和保护工作，特别是在鱼类性别染色体信息有限的情况下。蛇皮斗鱼（Trichopodus pectoralis）是一种雌性生长优势明显的淡水鱼；然而，迄今为止尚未报道过针对该物种的性别特异性DNA标记。因此，本研究旨在鉴定T. pectoralis中的性别相关标记。通过对幼鱼和成鱼的卵巢和睾丸进行基于转录组的单核苷酸多态性（SNP）分析，发现了21个候选的性别偏向性转录RNA SNP。对cDNA样本进行Sanger测序和PCR等位基因竞争扩展SNP分析后，发现ift172、man2a1、crk、cast和kap3l基因存在核苷酸变异，这些变异在雄性中表现为杂合子，在雌性中表现为纯合子。此外，ift172、man2a1和kap3l基因在雄性中表达较高，而crk基因在雌性中表达较高，这表明它们可能参与了生殖腺的分化和成熟过程。三个SNP（SNP_19、SNP_20和SNP_21）在其基因组中具有稳定的变异，表明它们具有用于基因型性别鉴定的潜力。其余四个RNA SNP（SNP_2、SNP_3、SNP_4和SNP_15）在基因组中未被检测到。此外，还观察到adar基因在雄性中的表达较高，这表明RNA编辑可能在蛇皮斗鱼的性别分化中起作用。不匹配敏感的T7内切酶I（T7EI）检测验证了SNP_19和SNP_20，为开发性别相关DNA标记提供了一种可靠且经济有效的方法。总之，本研究鉴定了T. pectoralis中的性别相关SNP，这些SNP可能成为性别鉴定的有用工具。
引言
在脊椎动物中，硬骨鱼类表现出多种性别决定机制，这些机制可能受遗传性别决定（GSD）、环境性别决定（ESD）或两者相互作用的影响（Devlin和Nagahama，2002）。一些鱼类在体型、体色和行为上存在性别二态性，而另一些鱼类则没有明显的性别差异（Mesnick和Ralls，2018；Uba，2019；Han等人，2020）。虽然不能排除ESD对性别分化的影响，但雄性和雌性之间的GSD差异可能成为生态学研究和水产养殖调查的宝贵工具（Rajendiran等人，2021）。然而，只有少数鱼类物种的性别染色体和性别决定基因已被鉴定（Kobayashi等人，2013；Wang等人，2024）。作为一种替代方法，性别相关标记已被广泛研究作为生态学和水产养殖研究中的实用工具（Martinez等人，2026；L. Zhang等人，2025）。
在缺乏外部性别二态性的物种中，分子性别标记对于监测自然种群中的性别比例特别有用，从而支持生态保护和保护工作（Vu等人，2019）。相比之下，温度依赖的性别决定（TSD）在气候变化下可能导致雄性比例增加，可能破坏种群动态并威胁生态平衡和生物多样性（Geffroy和Wedekind，2020；Ospina-álvarez和Piferrer，2008）。因此，性别相关标记可用于追踪种群层面的性别比例，并评估对热应激的生态响应。在水产养殖中，由于通常没有外部性别二态性，性别相关标记有助于识别性别，从而辅助人工选择育种计划（Abaho等人，2025；Curzon等人，2022）。而在成熟时表现出性别二态性的物种中（Kabpha等人，2023；Mu等人，2024），这些标记对于早期性别鉴定非常有价值。例如，新雄性（XX型表型为雄性的个体）可以用作亲本，通过间接的性别反转方法产生全雌性后代（Luckenbach等人，2017；Mu等人，2024）。在这种情况下，性别相关标记对于确定基因型性别至关重要，而不仅仅依赖于后代的性别比例。因此，性别相关标记对于生态学和水产养殖至关重要，特别是在鱼类性别染色体信息有限的地区。
生物信息学和分子遗传学的进步促进了鱼类基因组中性别特异性标记的发现（Chen等人，2007；Chen等人，2015；Hua等人，2023；Vale等人，2014）。然而，其他调控机制，如RNA编辑、表观遗传学和可变剪接，也可能通过改变转录水平的核苷酸变异和表达水平来影响性别决定和分化（Lu等人，2022；Wang等人，2020；Wang等人，2023）。因此，使用高通量RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析已成为量化并识别生物样本中RNA分子的强大方法。RNA-seq还能够识别单核苷酸多态性（SNP），这对于鉴定遗传标记非常有价值（Zhang等人，2024）。值得注意的是，基于转录组的SNP发现可以在不需要预先知道基因组序列的情况下获得潜在的RNA标记。此外，SNP是双等位的、可重复的，并且可以很容易地整合到高通量基因分型平台中，如PCR等位基因竞争扩展（PACE），从而实现可扩展和准确的分析（Torres等人，2025）。此外，转录组数据集已成功用于开发黑斑蛙（Pelophylax nigromaculatus）、黑脸鳚鱼（Tripterygion delaisi）和多种鲶鱼物种（Schunter等人，2014；Wang等人，2013；Zhang等人，2024）的SNP标记。
蛇皮斗鱼（Trichopodus pectoralis）是一种经济上重要的淡水鱼，在东南亚广泛分布和养殖。雌性通常比雄性体型更大；因此，使用添加17β-雌二醇的饲料进行雌性化处理已被用于促进全雌性后代的产生（Kabpha等人，2023）。或者，使用新雄性进行间接全雌性生产是一种可持续且安全的方法，可以提高生产力。此外，之前的基于RNA-seq的转录组分析发现了睾丸和卵巢之间的差异表达基因（DEGs），揭示了幼鱼和成鱼阶段性别分化和成熟过程中的分子途径（Boonanuntanasarn等人，2020；Jantawongsri等人，2025）。然而，尽管蛇皮斗鱼具有经济重要性，但其性别决定机制仍不清楚，迄今为止尚未报道过性别特异性DNA标记。
因此，在本研究中，我们应用基于转录组的SNP发现方法对幼鱼和成鱼蛇皮斗鱼进行了研究，以鉴定和验证候选的性别偏向性转录SNP。使用RT-PCR、Sanger测序和PACE SNP分析进行了标记验证，并整合了转录组和基因组数据，以帮助表征RNA和DNA水平上的性别相关核苷酸变异。我们的结果证明了不匹配敏感的T7内切酶I（T7EI）检测在验证DNA水平SNP基因型方面的有效性。此外，我们的结果提供了证据，表明RNA编辑可能在蛇皮斗鱼的性别分化中起作用。
章节片段
伦理声明和实验设计
鱼类护理和实验程序的研究方案已由Kasetsart大学机构动物护理和使用委员会（ACKU 61-FIS-004）审查并批准。所有程序均按照机构和国家指南进行。
进行了RNA测序，以确定与幼鱼（性别分化阶段）和成鱼（成熟阶段）蛇皮斗鱼之间的性别差异相关的SNP标记。
转录组组装和质量评估
从头转录组组装产生了165,063个unigenes，平均长度为1974 bp，N50值为3442 bp。最长转录本长度达到22,630 bp。转录本和unigenes的长度分布如图1B所示。结果显示，测序质量Q20值>95%，Q30值>88%，平均错误率约为0.02%，支持下游分析的可靠性。将清洁读段映射回组装的转录组进行评估
讨论
具有可用参考基因组的基因组测序方法已成为直接、高通量的工具，用于识别DNA标记，包括性别相关DNA区域/标记。然而，在参考基因组数据库有限的情况下，基于转录组的方法可以提供有效的SNP发现方法，同时还可以识别DEGs。因此，在本研究中，使用RNA-seq数据库筛选了幼鱼睾丸和卵巢中表达转录本中的候选SNP
结论
在幼鱼和成鱼蛇皮斗鱼中进行的基于转录组的SNP发现确定了七个位于ift172、man2a1、crk、cast和kap3l中的RNA SNP，这些SNP在睾丸和卵巢中的表达存在差异，表明核苷酸变异和表达水平与性别分化有关。这些SNP在雄性中表现为杂合子，在雌性中表现为纯合子，支持T. pectoralis中的XY性别决定系统。在这七个RNA SNP中，有三个显示出一致的核苷酸
CRediT作者贡献声明
张明华：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理。Phonsiri Khanakorn：方法学。Thongchaitriwat Sirijanya：方法学。Kubota Satoshi：数据管理。S. Boonanuntanasarn：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、数据管理、概念化。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
作者在写作过程中没有使用任何人工智能辅助技术。
致谢
本工作得到了（i）那空拉差西玛技术大学（SUT），（ii）泰国科学研究与创新机构（TSRI）和（iii）农业研究发展局（公共机构）（PRP6705031040）的资助支持。
